MENJAR. Chudinova, V.A. Platonov, A.V. Alexandrova, S.N. Elansky
Recentment, s'ha demostrat que el fong ascomicet Ilyonectria crassa és capaç d'atacar els tubercles de patata. Aquest treball va ser el primer a analitzar les característiques biològiques i la resistència a determinats fungicides de la soca I. crassa aïllada de la patata. Les seqüències de regions específiques de l'espècie de la soca "patata" van coincidir amb les obtingudes prèviament per a fongs aïllats de les arrels de narcís, ginseng, tremol i faig, bulbs de lliri i fulles de tulipa. Pel que sembla, moltes plantes silvestres i de jardí poden ser reserves per I. crassa. La soca estudiada va infectar rodanxes de tomàquet i patata, però no va infectar una fruita sencera de tomàquet ni un tubercle de patata intacte. Això demostra que I. crassa és un paràsit de la ferida. L'avaluació de la resistència a fludioxonil, difenoconazol i azoxistrobina en un medi nutritiu va mostrar l'alta efectivitat d'aquests fàrmacs.
L'indicador EC50 (concentració de fungicida que disminueix 2 vegades la velocitat de creixement radial de la colònia respecte al control no fungicida) va ser igual a 0.4; 7.4 i 4 mg/l, respectivament. S'ha de tenir en compte la possibilitat de desenvolupar una malaltia causada per I. crassa a l'hora d'avaluar fitopatològicament els tubercles de patata i desenvolupar mesures de protecció fitosanitària.
El desenvolupament de microorganismes fitopatògens comporta pèrdues elevades en totes les etapes de cultiu i emmagatzematge de la patata. A l'hora de planificar mesures de protecció, per regla general, es tenen en compte patògens coneguts, com ara espècies dels gèneres Alternaria, Fusarium, Phoma, Helminthosporium, Colletotrichum, Phytophthora, etc. No obstant això, en els darrers anys, han aparegut més i més informes. sobre l'aparició de nous microorganismes fitopatògens a les patates. La seva biologia està poc estudiada, es desconeix l'eficàcia dels fungicides utilitzats a les patates contra ells i no s'han desenvolupat mètodes de diagnòstic. Quan es desenvolupen massivament, són capaços de causar danys importants al cultiu de la patata. Un d'aquests microorganismes és el fong ascomicet Ilyonectria crassa (Wollenw.) A. Cabral & Crous, descobert per primera vegada pels autors en tubercles de patata (Chudinova et al., 2019).
Aquest article presenta els resultats d'una anàlisi de la soca d'I. crassa aïllada d'un tubercle de patata. Es va estudiar la morfologia de colònies i estructures micelials d'I. crassa, seqüències de nucleòtids de seccions d'ADN específiques d'espècie, virulència a patates i tomàquets i resistència a alguns fungicides populars.
Materials i mètodes
La soca utilitzada en aquest treball és I. crassa 18KSuPT2, aïllada el 2018 d'un tubercle de patata infectat cultivat a la regió de Kostroma. El tubercle estava afectat per podridura seca amb una cavitat coberta de miceli marró clar. Amb una agulla de dissecció estèril, el miceli fúngic es va transferir a una placa de Petri amb un medi d'agar (most de cervesa 10%, agar 1.5%, penicil·lina 1000 unitats/ml). Els plats es van incubar a les fosques a 24 °C.
Per a la fotografia, avaluació de la mida i morfologia de les espores i òrgans d'esporulació, es va utilitzar un microscopi de llum Leica DM2500 amb una càmera digital ICC50 HD i un microscopi binocular Leica M80 amb una càmera digital IC80HD (Leica Microsystems, Alemanya).
Per aïllar l'ADN, el miceli fúngic es va cultivar en medi líquid de pèsols, després es va congelar en nitrogen líquid, es va homogeneïtzar, es va incubar en tampó CTAB, es va purificar amb cloroform i es va rentar dues vegades amb alcohol al 2%.
El mètode d'extracció d'ADN es descriu en detall a l'article de Kutuzova et al. (2017).
Per determinar la identitat de les espècies mitjançant mètodes moleculars i comparar-les amb altres soques conegudes d'I. crassa, es va realitzar PCR amb cebadors que permetien l'amplificació de regions d'ADN específiques de l'espècie: ITS1-5,8S-ITS2 (primers ITS5/ITS4, White et al., 1990), regions dels gens b -tubulina (Bt2a/Bt2b, Glass i Donaldson, 1995) i el factor d'allargament de la traducció 1α (tef1α) (primers EF1-728F/EF1-986R, Carbone i Kohn, 1999). Els amplicons de la longitud requerida es van extreure del gel mitjançant el kit CleanUp d'Evrogen. Les regions amplificades es van seqüenciar mitjançant el kit de seqüenciació de cicle BigDye®Terminator v3.1 (Applied Biosystems, CA, EUA) en un seqüenciador automatitzat Applied Biosystems 3730 xl (Applied Biosystems, CA, EUA). Les seqüències de nucleòtids obtingudes es van utilitzar per buscar una coincidència a la base de dades GenBank del National Center for Biotechnology Information (NCBI) dels EUA. L'anàlisi filogenètica es va realitzar mitjançant el programa MEGA 6 (Tamura et al., 2013).
La determinació de la virulència es va dur a terme en fruits verds sencers de tomàquet de fruita grossa (varietat Dubrava) i tubercles de patata (varietat Gala). A més, per simular danys als fruits i tubercles danyats, es van utilitzar rodanxes dels mateixos fruits i tubercles. Les rodanxes de tubercle es van col·locar en cambres humides, que eren plaques de Petri amb paper de filtre humit a la part inferior. Es col·locava un portaobjectes de vidre sobre el paper, sobre el qual, al seu torn, es col·locaven rodanxes de tubercles o fruites. També es van col·locar tubercles i fruites sencers en recipients amb paper de filtre humit a la part inferior. Es va col·locar un tros d'agar (5 × 5 mm) amb hifes de fongs al centre de la llesca (o a la superfície intacta del tubercle o fruit) amb hifes de fongs després de 5 dies de cultiu en agar de most.
La resistència de les soques de fongs als fungicides es va avaluar en condicions de laboratori en un medi nutritiu d'agar. Hem estudiat la susceptibilitat als fàrmacs fungicides Maxim, KS (principi actiu fludioxonil, 25 g/l), Quadris, KS (azoxystrobin 250 g/l), Skor, CE (difenoconazol 250 g/l) (Catàleg estatal..., 2020). ). L'avaluació es va dur a terme en plaques de Petri en medi de most-agar amb l'addició dels fàrmacs estudiats a una concentració de la substància activa de 0.1; 1; 10 ppm (mg/l) (per a fludioxonil i difenoconazol), 1; 10; 100 ppm (per azoxistrobina) i en un medi sense fungicida (control). El fungicida es va afegir al medi fos i es va refredar a 60 ° C, després de la qual cosa es va abocar el medi a les plaques de Petri. Es va col·locar un bloc d'agar amb miceli fúngic al centre d'una placa de Petri i es va conrear a una temperatura de 24 °C a la foscor. Després de 7 dies d'incubació, es van mesurar els diàmetres de les colònies en dues direccions mútuament perpendiculars; es van promediar els resultats de mesura per a cada colònia. Els experiments es van realitzar per triplicat. A partir dels resultats de la prova, es va calcular l'índex EC50, igual a la concentració de fungicida que va reduir a la meitat la taxa de creixement radial de la colònia respecte al control no fungicida.
Resultats i discussió
A les plaques de Petri amb agar de most, el fong va formar colònies amb miceli blanc escamoss. El medi sota el miceli es va tornar marró vermellós. Quan el medi es va assecar, el fong va formar dos tipus d'espores en conidiófors únics i les agregades en petits esporodoquis. Els macroconídis són allargats, cilíndrics, amb un a tres septes, una longitud mitjana de 27.2 µm amb un rang de valors de 23.2 a 32.2 µm, una amplada de fins a 4.9 µm (Fig. 1). La longitud mitjana dels microconídis és de 14.3 µm amb un rang de valors de 10.3 a 18.1 µm, amplada de fins a 4.0 µm. Tots els caràcters macro i micromorfològics es troben dins del rang de variació de l'espècie Ilyonectria crassa (Cabral et al., 2012).
Les seqüències de regions d'ADN específiques de l'espècie (ITS, b-tubulina, TEF 1α) van coincidir completament amb les seqüències de les soques d'I. crassa que vam estudiar anteriorment (Chudinova et al., 2019, Taula 1). Per tal d'estudiar la prevalença d'I. crassa en altres regions i analitzar l'espectre de cultius afectats, es van analitzar seqüències d'ADN similars a la base de dades GenBank (Taula 1). La superposició oscil·lava entre el 86 i el 100%. Les seqüències de les tres regions d'ADN de la soca "patata" d'I. crassa eren idèntiques a les seqüències de soques aïllades de bulbs de lliri i arrels de narcís als Països Baixos i de l'arrel de ginseng al Canadà. No hem pogut trobar cap altra soca d'I. crassa amb les tres seqüències similars analitzades a bases de dades obertes. Tanmateix, l'anàlisi de les seqüències d'ITS i b-tubulina dipositades va revelar la presència d'I. crassa a les fulles de tulipa al Regne Unit. Es van identificar fongs amb una seqüència d'ITS similar en analitzar la micobiota d'arrels de tremol al Canadà i faig a Itàlia i tubercles de patata a l'Aràbia Saudita (taula 1). Els resultats d'aquest estudi indiquen que I. crassa té una distribució global i és capaç d'atacar diferents espècies vegetals.
Quan es va determinar la patogenicitat en rodanxes de tomàquet i patata el dia 5, el diàmetre de la lesió va arribar als 1.5 cm.Al mateix temps, la soca estudiada no va infectar un fruit de tomàquet sencer ni un tubercle de patata intacte. No obstant això, es va observar danys als sèpals al tomàquet. Per excloure la possibilitat de contaminació, es va aïllar un aïllat de fongs en un cultiu pur del miceli que es va desenvolupar en una llesca de tubercle de patata. Era completament idèntic a la soca parental. I. crassa sembla ser un paràsit de la ferida.
El tractament previ a la plantació de tubercles de llavors amb fungicides pot reduir el desenvolupament de malalties a les plantes durant la temporada de creixement. Per seleccionar fungicides efectius, és important avaluar quins són eficaços contra I. crassa. El treball va estudiar ingredients actius àmpliament utilitzats dels fungicides: fludioxonil, azoxistrobin, difenoconazol. El fludioxonil forma part de diverses preparacions mixtes que s'utilitzen per tractar llavors i tubercles de llavors abans de la sembra. Fludioxonil (Maxim) també s'utilitza per tractar tubercles de llavors abans d'emmagatzemar-los. El difenoconazol i l'azoxistrobina també s'inclouen en una sèrie de preparats utilitzats per processar material de llavors, així com en preparats destinats al processament de plantes vegetatives (Catàleg estatal..., 2020).
La taxa de creixement d'I. crassa es va estudiar en medis (Fig. 2) amb diferents concentracions de principis actius: fludioxonil (EC50 = 0.4 ppm), azoxistrobina (EC50 = 4 ppm) i difenoconazol (EC50 = 7.4 ppm) (Taula 2) . Aquests fàrmacs es poden considerar molt efectius contra I. crassa, ja que la seva EC50 és significativament inferior a la concentració recomanada del fàrmac en el fluid de treball utilitzat per tractar tubercles. Segons el Catàleg Estatal... (2020), la concentració de fludioxonil en el líquid per tractar tubercles de patata oscil·la entre 500 i 1000 ppm, azoxistrobina (al líquid per tractar el fons del solc) - 3750-9375 ppm, difenoconazol (en el líquid per al tractament de plantes vegetatives) – 187.5– 625 ppm.
Taula 1. Similitud de seqüències entre seqüències específiques d'espècie de soques 18KSuPT2 i Ilyonectria crassa disponibles a la base de dades Genbank
Colar | Planta hoste, lloc d'excreció | Números de seqüència dipositats a GenBank, percentatge de semblances | Enllaç | ||
SEU | β-tubulina | TEF 1α | |||
17KSPT1 i 18KSuPT2 | Tubercle de patata, regió de Kostroma. | MH818326 | MH822872 | MK281307 | Chudinova et al., 2019, aquest treball |
CBS 158/31 | Arrels de narcisos, Països Baixos | JF735276 100 | JF735394 100 | JF735724 99.3 | Cabral et al., 2012 |
CBS 139/30 | Bulb de lliri, Països Baixos | JF735275 100 | JF735393 99.7 | JF735723 99.3 |
|
NSAC-SH-1 | Arrel de ginseng, Canadà | AY295311 99.4 | JF735395 100 | JF735/725 99.6 |
|
RHS235138 | Fulla de tulipa, Regne Unit | KJ475469 100 | KJ513266 100 | ND | Denton, Denton, 2014 |
MT294410 | Arrels Aspen, Canadà | MT294410 100 | ND | ND | Ramsfield et al., 2020 |
ER1937 | Buc, Itàlia | KR019363 99.65 | ND | ND | Tizzani, Haegi, Motta. Presentació directa |
KAUF19 | Tubercle de patata, Aràbia Saudita | HE649390 98.3 | ND | ND | Gashgari, Gherbawy, 2013 |
ND = no dipositat
Taula 2. Resistència d'Ilyonectria crassa als fungicides
(substància activa) | EC50, ppm | ||||
Dia 3 | Dia 5 | Dia 7 | |||
Controli | 17 2 ± | 33 5 ± | 47 3 ± | ||
Quadris, KS (fzoxistrobina) | 18 1 ± | 34 2 ± | 48 2 ± | ||
11 1 ± | 11 1 ± | 12 1 ± | |||
11 1 ± | 11 1 ± | 12 1 ± | |||
Maxim, KS (fludioxonil) | 16 1 ± | 28 2 ± | 48 2 ± | ||
7 1 ± | 13 3 ± | 19 4 ± | |||
5 1 ± | 12 1 ± | 17 5 ± | |||
Puntuació, EC (difenoconazol) | 18 1 ± | 35 2 ± | 48 1 ± | ||
11 1 ± | 24 3 ± | 35 4 ± | |||
11 1 ± | 13 1 ± | 17 3 ± |
En el nostre treball, les soques d'I. crassa es van aïllar de tubercles de patata a les regions de Kostroma i Moscou (Chudinova et al., 2019). Es va identificar una proporció elevada de soques de fongs amb seqüències d'ITS idèntiques a I. crassa en analitzar la micobiota de tubercles de patata a l'Aràbia Saudita (Gashgari i Gherbawy, 2013). Pel que sembla, I. crassa no és tan rar a les patates com podria semblar. Els nostres experiments van demostrar que el fong podria infectar els fruits de tomàquet danyats. Se sap per la literatura que I. crassa és capaç de desenvolupar-se saprotròficament al sòl (Moll et al., 2016), i també infectar una gran varietat de plantes, fins i tot aquelles tan distants en termes taxonòmics com els narcisos, els lliris, el ginseng, tremol, i faig (taula 1). Pel que sembla, moltes plantes silvestres i de jardí poden ser reserves per I. crassa. L'anterior mostra que quan es desenvolupen mesures de protecció, cal tenir en compte la possibilitat de danys als tubercles de patata per aquest fong. Els preparats àmpliament utilitzats per al tractament de tubercles de patata, que contenen fludioxonil, azoxistrobina i difenoconazol, han demostrat una gran eficàcia fungicida contra I. crassa.
El treball va comptar amb el suport de la Fundació Russa per a la Recerca Bàsica (subvenció núm. 20-016-00139).
L'article es va publicar a la revista "Bulletin of Plant Protection", 2020, 103(3)