D. Yu. Ryazantsev, E. M. Chudinova, L. Yu. Kokaeva, S. N. Elansky, P. N. Balabko, G. L. Belova, S. K. Zavriev
El fong fitopatogènic Colletotrichum coccodes causa malalties perilloses en les patates i els tomàquets coneguts com a taca negra d’antracnosa i tubercles. Per característiques morfològiques, sovint són difícils de distingir de les malalties causades per altres microorganismes; en els fruits de tomàquet verd, la malaltia pot ser asimptomàtica, manifestant-se només en els fruits vermells madurs. Per a un diagnòstic ràpid i precís del patogen, s’ofereix un sistema de proves de PCR en temps real. Per desenvolupar un sistema de proves, es va determinar la seqüència de nucleòtids del gen glicerol trifosfat deshidrogenasa de soques de 45 C. coccodes aïllades de tubercles de patata a diferents regions de Rússia.
A partir dels resultats obtinguts i de l'anàlisi de seqüències similars d'altres espècies disponibles a la base de dades GenBank, es van dissenyar els primers i la sonda específics de l'espècie per a C. coccodes. Per comprovar l’especificitat del sistema de proves creat, es va realitzar PCR amb ADN aïllat de cultius purs de 15 espècies diferents de fongs paràsits i saprotròfics associats a les plantes de tomàquet i patata (Fusarium oxysporum, F. verticillium, Phomopsis phaseoli, Alternaria alternata, Helminthosporium solani, Colletotrichum coccodes Phellinus ferrugineovelutinus, Stemphylium vesicarium, Helminthosporium solani, Phomopsis phaseoli, Neonectria radicicola, Rhizoctonia solani, Penicillium sp., Cladosporium fulvum, C. cladosporioides). La presència d'ADN de Colletotrichum coccodes es va determinar en un cicle llindar de 20 a 27, mentre que altres espècies es van detectar després de 40 cicles o no es van detectar. El sistema de prova permet detectar de forma fiable concentracions d’ADN de C. coccodes superiors a 0.01 ng / mm3 a la barreja de PCR analitzada. Mitjançant el sistema de proves desenvolupat, es va investigar la presència de C. coccodes a les fulles de tomàquet amb símptomes de malalties fúngiques i en tubercles de patata sense símptomes externs de la malaltia. Les fulles amb símptomes d’infecció per fongs es van recollir de dos camps diferents del territori de Krasnodar, tubercles: de camps de les regions de Kostroma, Moscou, Kaluga, Nizhny Novgorod. Es va trobar una fulla de tomàquet que contenia ADN de C. coccodes al territori de Krasnodar; es va detectar una presència significativa d’ADN d’aquest patogen en 5 mostres de tubercles cultivats a les regions de Kostroma, Moscou i Kaluga.
Introducció
Els bolets del gènere Colletotrichum són fitopatògens perillosos que afecten cereals, verdures, herbes, fruites perennes i plantes de baies. Una de les espècies omnipresents d’aquest gènere, Colletotrichum coccodes (Wallr).
Hughes, és l'agent causant de l'antracnosa i la taca negra de patates i tomàquets, i causa malalties d'altres plantes de la família de les Solanàcies, incl. males herbes (Dillard, 1992). C. coccodes infecta totes les parts subterrànies de la planta, bases de la tija, fulles i fruits (Andrivon et al., 1998; Johnson, 1994). A la pell dels tubercles de patata infectats s’observa el desenvolupament de taques grises amb vores pronunciats indistintament, sobre les quals es veuen clarament punts negres d’esporulació i microscleròtia. Durant l’emmagatzematge, es poden formar úlceres amb contingut suavitzat a la polpa dels tubercles, és a dir, la malaltia entra en la fase d'antracnosi, que, però, és extremadament rara.
Al mateix temps, els símptomes de l’antracnosa (úlceres cutànies amb petits punts negres) són típics dels fruits del tomàquet. A les fulles, els símptomes de C. coccodes apareixen com taques marrons fosques, generalment vorejades per teixit groc (Johnson, 1994).
El desenvolupament de taques negres als tubercles fa malbé el seu aspecte, que es manifesta especialment quan es venen patates de pell vermella rentades. L’exfoliació de la pell provoca un excés d’evaporació i augmenta les pèrdues d’emmagatzematge (Hunger, McIntyre, 1979). El dany a altres òrgans vegetals condueix a la pèrdua de rendiment, que es va observar tant en terreny obert com tancat (Johnson, 1994; Tsror et al., 1999). Les malalties causades per C. coccodes són freqüents a gairebé totes les regions productores de patates del món, inclosa Rússia (Leesa, Hilton, 2003; Belov et al, 2018). El control d’aquestes malalties és difícil a causa de l’eficàcia insuficient dels fungicides existents contra C. coccodes i de la manca de varietats resistents (Read, Hide, 1995).
L’inòcul de C. coccodes pot persistir en tubercles de llavors (Read, Hide, 1988; Johnson et al., 1997), llavors de tomàquet (Ben-Daniel et al., 2010), poden sobreviure durant molt de temps al sòl, a les restes vegetals (Dillard, 1990 ; Dillard, Cobb, 1993) i en males herbes (Raid, Pennypacker, 1987). Els treballs de diversos autors (Read, Hide, 1988; Barkdoll, Davis, 1992; Johnson et al., 1997; Dillard, Cobb, 1993) han demostrat que el desenvolupament de la malaltia en les patates i els tomàquets depèn en gran mesura de la presència d’inòcul a les llavors i terra. Per tant, per minimitzar les pèrdues de la malaltia, és necessari diagnosticar (inclosa la quantitativa) els propàguls del fong al material de la llavor, al sòl, als tubercles de patata de llavors i a les llavors de tomàquet posades per emmagatzemar. El diagnòstic morfològic en el sòl i el material vegetal només es pot dur a terme mitjançant la presència de microsclerotis, que, però, també es troben en altres tipus de fongs.
Els símptomes als tubercles són molt similars a la crosta de plata causada pel fong Helminthosporium solani. L’aïllament de Colletotrichum coccodes i Helminthosporium solani en un cultiu pur és bastant difícil i dura molt de temps a causa del lent creixement d’un medi nutritiu. Per identificar ràpidament els coccodes de Colletotrichum, és necessari utilitzar mètodes de diagnòstic instrumental. El mètode més convenient és la reacció en cadena de la polimerasa (PCR) i la seva modificació: la PCR en temps real. Actualment, a Europa i als Estats Units s’utilitza un sistema de proves desenvolupat per investigadors britànics (Cullen et al., 2002) per a la regió ITS1 de l’ADNr. El seu ús ha mostrat bons resultats en l’anàlisi d’aïllats russos (Belov et al, 2018). No obstant això, C. coccodes és molt variable i la seva detecció a partir d’una única seqüència d’ADN pot conduir a resultats falsos negatius. Per obtenir un diagnòstic més fiable, cal fer anàlisis de diverses seqüències d’ADN específiques d’espècies i, per tant, hem desenvolupat un sistema de proves original que permet identificar C. coccodes mitjançant la seqüència del gen gliceraldehid-3-fosfat deshidrogenasa.
Materials i mètodes
Per avaluar l’eficàcia i l’especificitat dels sistemes de proves creats, hem utilitzat cultius purs de 15 espècies de fongs aïllats pels autors de mostres malaltes de fulles i fruits de tomàquet, tubercles de patata (taula 1). Per a l’aïllament, vam prendre òrgans de plantes amb símptomes d’infecció per fongs, no més d’un òrgan per arbust.
Es va col·locar una rodanxa de tubercle amb una pell, una rodanxa de tomàquet i una fulla afectada sota un microscopi binocular, després del qual es van transferir miceli, espores o un tros de teixit a un mitjà d’agar (agar d’herba) en una placa de Petri amb una agulla de dissecció afilada. Els aïllats es van emmagatzemar en biaix agar en provetes a 4 ° C.
Les mostres de fulles de tomàquet amb símptomes de malalties fúngiques destinades a l’anàlisi es van col·locar immediatament després de la recollida (al camp) en un 70% d’alcohol etílic on es van emmagatzemar fins a l’aïllament de l’ADN. Es van lliurar tubercles de patata al laboratori, es van pelar (peça de 2 × 1 cm) i es van congelar a –20 ° С. Emmagatzemat congelat fins a l’aïllament de l’ADN.
Els cultius purs de fongs per a l'aïllament de l'ADN es van cultivar en medi líquid de pèsols. El miceli del fong es va eliminar del medi líquid, es va assecar sobre paper de filtre, es va congelar en nitrogen líquid, es va homogeneïtzar, es va incubar en tampó CTAB, es va purificar amb cloroform, es va precipitar amb una barreja d’isopropanol i 0.5 M d’acetat de potassi, es va rentar dues vegades amb un 2% d’alcohol. L’ADN resultant es va dissoldre en aigua desionitzada i es va emmagatzemar a –70 ° С (Kutuzova et al., 20). La concentració d’ADN es va mesurar mitjançant un kit de quantificació d’ADN HS per a ADN de doble cadena a Qubit 2017 (Qiagen, Alemanya). Les mostres alcoholitzades i congelades es van triturar en nitrogen líquid i, a continuació, es va dur a terme l'extracció d'ADN de la mateixa manera que es va descriure anteriorment (per al miceli de cultius de fongs purs).
Taula 1. Origen de les soques de fongs usats
Nom del bolet | Planta, òrgan | Lloc de selecció |
---|---|---|
Colletotrichum coccodes 1, C. coccodes 2, C. coccodes 3, Ilyonectria crassa, Rhizoctonia solani | tubercle de patata | Regió de Kostroma, tubercles de patata de la primera generació de camp, cultivar Red Scarlett |
Colletotrichum cocodes 4 | full de patata | Rep. Mari El, Yoshkar-Ola |
Helminthosporium solani | tubercle de patata | Regió de Magadan, pos. Tenda de campanya, tubercle de la patata |
Cladosporium fulvum | fulla de tomàquet | Regió de Moscou, tomàquet de fruits grans |
Alternaria tomatophila | fruita de tomàquet | lliurat pel personal del laboratori de micologia i fitopatologia de l’Institut d’Investigació de Protecció Vegetal de tota Rússia |
Fusarium verticillium, Phomopsisphaseoli, Alternaria alternata, Phellinus ferrugineovelutinus, Stemphylium vesicarium, Cladosporium cladosporioides, Acrodontium luzulae, Penicillium sp. | fruita de tomàquet | Territori de Krasnodar, districte de Krymsky, grau Cream |
Fusarium oxysporum | arrel de blat | Regió de Moscou |
La PCR es va realitzar en un amplificador DTprime (DNA-Technology). Per a la PCR, es van utilitzar primers inicials i una sonda per a la regió específica del gen del glicerol trifosfat deshidrogenasa: imprimació directa Coc70gdf –TCATGATATCATTTCTCTCACGGCA, imprimació inversa Coc280gdr - TACTTGAGCATGTAGGCCTGGGT1). Els primers amplifiquen una regió de 213 pb.
La reacció va prendre 50 ng d’ADN total (en analitzar fulles i tubercles) i 10 ng (en analitzar ADN de cultius de fongs purs). La barreja de reacció (35 μl) es va separar per una capa de parafina en dues parts: la inferior (20 μl) contenia 2 μl de tampó de reacció 10 × (750 mM Tris-HCl, pH 8.8; 200 mM (NH4) 2SO4; 25 mM MgCl2; 0.1% Tween- 20), 0.5 mM de cada trifosfat de desoxinucleòtid, 7 pmol de cada imprimació i 4 pmol d’una sonda fluorescent hidrolitzable; la superior contenia 1 μl de tampó PCR 10 × i 1 U de polimerasa Taq.
La separació de la barreja amb parafina permet emmagatzemar els tubs durant molt de temps a una temperatura de 5 ° C i proporcionar un arrencada en calent per a la PCR després d’escalfar-los durant 10 min a una temperatura superior a 80 ° C. La PCR es va realitzar segons el programa següent: 94.0 ° C - 90 s (1 cicle); 94.0 ° C - 30 s; 64.0 ° C - 15 s (5 cicles); 94.0 ° C - 10 s; 64.0 ° C - 15 s (45 cicles); 10.0 ° C: emmagatzematge.
Resultats i discussió
Les seqüències del gen glicerol trifosfat deshidrogenasa es van determinar en 45 soques aïllades de fulles, tiges, tubercles de patata i fruits del tomàquet (Kutuzova, 2018) a diferents regions de Rússia. Les seqüències estudiades de totes les soques es van dividir en 2 grups que es diferencien en dos nucleòtids. Les seqüències de nucleòtids de representants d'ambdós grups amb els números KY496634 i KY496635 es dipositen a GenBank.
Els primers coc70gdf, coc280gdr i la sonda cocgdz dissenyats sobre la seva base es van comprovar mitjançant el programa BLAST (www.ncbi.nlm.nih.gov/blast) en totes les seqüències del gen glicerol trifosfat deshidrogenasa d'espècies del gènere Colletotrichum i d'altres organismes disponibles a la base de dades GenBank.
No es van trobar regions d’ADN d’altres organismes altament homòlegs amb els primers i la sonda.
La sensibilitat del sistema de prova es va comprovar mitjançant mostres amb diferents concentracions d’ADN de C. coccodes, ADN d’una fulla de patata infectada amb antracnosa (recollida el 2017 a Mari El, varietat Red Scarlett) i pell de tubercles afectats per la taca negra (recollida a la regió de Kostroma, varietat Red Scarlett, taula 2). Per confirmar la presència d’ADN en tubercles i fulles de patata, es van aïllar les soques de C. coccodes en cultius purs.
Els resultats de l'anàlisi de sensibilitat del sistema de prova mostren que es pot utilitzar per diagnosticar amb èxit la presència d'ADN de C. coccodes en una mostra quan el seu contingut total a la barreja de PCR és superior a 0.05 ng. Això és bastant suficient per a la detecció, ja que una escleròtia conté de mitjana 0.131 ng i una espora conté aproximadament 0.04 ng d’ADN (Cullen et al., 2002). El sistema de proves desenvolupat pel grup anglès (Cullen et al., 2002) va mostrar una sensibilitat similar (cicle llindar 34 a 0.05 ng d’ADN i 37 a 0.005 ng).
L’anàlisi de mostres naturals que contenen C. coccodes en tots els casos va permetre revelar de forma fiable la seva presència a la mostra (taula 2). El mètode proposat per a l'aïllament d'ADN també va ser aplicable per a l'anàlisi de mostres de plantes naturals.
Taula 2. Determinació de la sensibilitat del sistema de prova proposat per a la identificació de coccodes de Colletotrichum per a PCR en temps real
Образец | La quantitat d'ADN de la mostra *, ng | Cicle llindar | C. detecció de coccodes |
---|---|---|---|
Mycelium Colletotrichum coccodes | 50 | 21.3 | + |
5 | 25.7 | + | |
0.5 | 29,7 | + | |
0.05 | 33.5 | + | |
0.005 | 40 | - | |
0.0005 | 42.8 | - | |
0.00005 | - | ||
Pela de tubercles 1 | 50 | 32 | + |
Pela de tubercles 2 | 50 | 30 | + |
Pela de tubercles 3 | 50 | 31.5 | + |
Full de patata | 50 | 29.5 | + |
Nota. * En una barreja de productes de PCR.
Es va comprovar l’especificitat del sistema de proves en mostres d’ADN extretes de 15 espècies de fongs. Els autors van aïllar totes les soques de fongs de fruites i fulles de tomàquet i tubercles de patata afectades i saludables; es va aïllar una soca de l'arrel de blat (taula 1). Entre les espècies aïllades de la superfície del fruit, també hi ha espècies que no són patògenes per al tomàquet (per exemple, Phellinus ferrugineovelutinus).
Els estudis han demostrat que l'ADN de C. coccodes es va detectar en un cicle llindar de 20 a 27, mentre que altres espècies de fongs no es van detectar ni van donar un senyal després del cicle 40, cosa que es pot atribuir a un efecte de soroll inespecífic (taula 3).
Taula 3. Prova del sistema de proves per a diversos tipus de bolets
Nom del bolet | Cicle llindar |
Colletotrichum cocodes 1 | 20.9 |
C. cocodes 2 | 22.6 |
C. cocodes 3 | 23 |
C. cocodes 4 | 22 |
Fusarium oxysporum | > 40 |
F. verticalillium | > 40 |
Rizozoctònia solani | > 40 |
Phomopsis phaseoli | > 40 |
Alternaria alternata | > 40 |
A. tomatophila | > 40 |
Helminthosporium solani | > 40 |
Phellinus ferrugineolutinus | > 40 |
Stemphylium vesicarium | > 40 |
Ilyonectria crassa | > 40 |
Cladosporium cladosporioides | > 40 |
C. fulvum | > 40 |
Acrodontium luzulae | > 40 |
penicillium NS. | > 40 |
Nota. * La quantitat d'ADN en totes les mostres era de 10 ng.
El sistema de proves desenvolupat es va utilitzar per identificar C. coccodes en mostres de fulles de tomàquet amb símptomes de patògens necròtrofs i tubercles de patata de llavor sense símptomes visibles. Per a l'estudi, hem pres tubercles de llavors de diferents varietats cultivades a les regions de Kostroma, Moscou, Kaluga, Niĵni Novgorod. La presència d’ADN de C. coccodes es va considerar significativa a les mostres, en l’anàlisi de les quals el cicle llindar no va superar els 35. Aquest valor llindar es va seleccionar a partir de la determinació fiable de 0.05 ng d’ADN de C. coccodes (cicle llindar 33.5, taula 2) i del fet en cicles llindars superiors a 40, es va diagnosticar ADN inespecífic d'algunes altres espècies de fongs. Amb aquest enfocament, es va detectar una presència significativa d’ADN de C. coccodes en 5 mostres de tubercles cultivats a les regions de Kostroma, Moscou, Kaluga i en una fulla de tomàquet del districte Yeisk de la regió de Krasnodar (Taules 4, 5).
Taula 4. Detecció de coccodes Colletotrichum en tubercles de patata *
Número de mostra | Varietat de patates | Lloc de creixement | C. detecció de coccodes | Cicle llindar |
---|---|---|---|---|
1 | Escarlata vermella | Regió de Kostroma | + | 35 |
2 | + | 35 | ||
3 | - | 38 | ||
4 | Sant | Regió de Moscou | + | 34 |
5 | - | |||
6 | - | 41 | ||
7 | - | 41.8 | ||
8 | + | 30 | ||
9 | Zhukovsky d'hora | Regió de Moscou | - | 40.5 |
10 | - | 40.6 | ||
11 | - | |||
12 | Molly | Regió de Kaluga | + | 34.3 |
13 | - | 38.4 | ||
14 | Fantasia | Regió de Kaluga | - | |
15 | Gala | regió de Nizhny Novgorod. | - | |
16 | - |
Nota. * La quantitat d'ADN en totes les mostres era de 50 ng.
Taula 5. Detecció de coccodes Colletotrichum a les fulles de tomàquet *
Número de mostra | Lloc de creixement | C. detecció de coccodes | Cicle llindar |
---|---|---|---|
1 | Territori de Krasnodar, districte de Crimea | - | |
2 | - | ||
3 | - | ||
4 | - | 45 | |
5 | - | ||
6 | - | ||
7 | - | ||
8 | - | ||
9 | Territori de Krasnodar, districte de Yeisk | - | 39.2 |
10 | - | 40.8 | |
11 | - | ||
12 | - | 41.6 | |
13 | - | 40 | |
14 | - | 41 | |
15 | - | 41.9 | |
16 | - | ||
17 | - | ||
18 | - | 40.3 | |
19 | - | ||
20 | - | ||
21 | + | 34.5 | |
22 | - | ||
23 | - |
* La quantitat d'ADN en totes les mostres era de 50 ng.
El sistema de proves creat per nosaltres no és inferior al desenvolupat per investigadors britànics (Cullen et al., 2002) en sensibilitat i especificitat i és adequat per a l’anàlisi de mostres de plantes. La seva aplicació per a l'anàlisi de tubercles de llavors va permetre identificar l'ADN de C. coccodes en tubercles sense signes externs de dany i analitzar amb èxit la infecció de fulles.
Fins ara no s’ha realitzat cap anàlisi de tubercles de patata per a la infestació de C. coccodes a Rússia. El nostre primer estudi va demostrar que de 16 tubercles de llavors provats cultivats a diferents regions de la Federació de Rússia, 5 contenen C. coccodes. Això demostra que la taca negra dels tubercles de patata és una malaltia freqüent de la patata a Rússia i que es subestima el seu paper en la reducció del volum i la qualitat del cultiu de patata.
L'anàlisi de les fulles de tomàquet va revelar una presència significativa d'ADN de C. coccodes en una fulla del districte Yeisk del territori de Krasnodar. Anteriorment, en examinar camps de tomàquet al sud de Rússia mitjançant el sistema de proves britànic (Cullen et al., 2002), es van trobar fulles que contenien C. coccodes i, en alguns camps, es va trobar una elevada proporció de fulles infectades amb C. coccodes (Belov et al., 2018). Als territoris de Krasnodar i Primorsky, a la regió de Moscou, vam trobar fruits de tomàquet, dels quals vam aconseguir aïllar cultius purs de C. coccodes. És possible que C. coccodes estigui molt més estès al tomàquet a Rússia del que es creu ara, i la seva nocivitat també es subestima.
Així, fins a la data s’ha acumulat prou informació sobre la distribució generalitzada de C. coccodes a les patates i els tomàquets.
Per comprendre millor el paper d’aquest fong en el desenvolupament de malalties de la patata i el tomàquet, es requereix un seguiment exhaustiu de la seva prevalença a Rússia, l’estudi del paper de la infecció del sòl i de les llavors i el paper de la taca negra en les pèrdues durant l’emmagatzematge. L’ús de diagnòstics de PCR pot facilitar significativament aquest treball i l’ús simultani d’ambdós sistemes de prova augmentarà significativament la precisió de l’anàlisi.
Aquest treball va rebre el suport de la subvenció núm. 18-76-00009 de la Russian Science Foundation.
L’article es va publicar a la revista "Mycology and Phytopathology" (volum 54, núm. 1, 2020).