S.N. Elansky, L.Yu. Kokaeva, N.V. Statsyuk, Yu.T. Dyakov
Introducció
Oomycete Phytophthora infestans (Mont.) De Bary, l’agent causant del tizó tardà, la malaltia econòmicament més important de les patates i els tomàquets, ha cridat l’atenció dels investigadors de diferents països durant més d’un segle i mig. Aparegut sobtadament a Europa a mitjan segle XIX, va provocar una epidèmia de patata que ha quedat en la memòria de moltes generacions.
Fins ara, sovint se l’anomena “bolet de la fam irlandesa”. Quasi cent anys després de les primeres epidèmies, es van descobrir espècies de patates salvatges mexicanes resistents al tizó tardà, es van desenvolupar mètodes per creuar-les amb patates cultivades (Muller, 1935) i es van obtenir les primeres varietats resistents a la tos tardana (Pushkarev, 1937). Tanmateix, poc després de començar el seu cultiu comercial, es van acumular races del patogen del tizó tardà que eren virulents a les varietats resistents. i la introducció de nous gens de resistència de les patates salvatges mexicanes a les varietats va començar a perdre efectivitat ràpidament.
Els fracassos en l’ús de la resistència monogènica (vertical) van obligar els criadors a buscar maneres més complexes d’explotar la resistència poligènica (horitzontal) inespecífica. En els darrers anys, les races altament agressives han començat a acumular-se en poblacions individuals del paràsit, provocant una erosió fins i tot de resistències inespecífiques. L’aparició de soques resistents a fungicides ha provocat problemes en l’ús de productes químics de protecció de la patata.
A causa de les diferències significatives entre oomicets i fongs en la composició química, la ultraestructura i el metabolisme, els fungicides, especialment els sistèmics, que s’utilitzen per protegir les plantes de moltes malalties fúngiques, són ineficaços contra els oomicets.
Per tant, en la protecció química contra la tos tardana, es va utilitzar una polvorització múltiple (fins a 12 vegades per temporada o més) amb preparacions de contacte d’un ampli espectre d’acció. Un pas revolucionari va ser l’ús de fenilamides, que són tòxiques per als oomicets i es propaguen sistemàticament a les plantes. No obstant això, el seu ús generalitzat va conduir ràpidament a l'acumulació de soques resistents en poblacions de fongs (Davidse et al., 1981), cosa que va complicar significativament la protecció de les plantes. P. infestans és pràcticament l’únic paràsit de la zona temperada, el mal que no es pot neutralitzar en l’agricultura ecològica sense l’ús de mitjans químics de protecció (Van Bruggen, 1995).
L’anterior explica la gran atenció que els investigadors de diferents països dediquen a l’estudi de les poblacions de P. infestans, la dinàmica de la seva abundància i composició genètica, així com els mecanismes genètics de variabilitat.
Cicle de vida de R. INFESTANS
Oomycete Phytophthora infestans desenvolupa un miceli intercel·lular amb haustòria dins de les fulles de la patata. Alimentant-se dels teixits de la fulla, provoca la formació de taques fosques, que es tornen negres i es podreixen en temps humit. Amb una forta derrota, tota la fulla mor. Després d’un període d’alimentació, es formen excrecions al miceli (esporangiòfors) que creixen cap a fora a través dels estomes. En temps humit, formen una floració blanca al voltant de les taques de la part inferior de les fulles. Als extrems dels esporangiòfors, es formen zoosporangis en forma de llimona, que es trenquen i són transportats per ruixats de pluja (Fig. 1). Entrant en gotes d’aigua a la superfície d’una fulla de patata, els esporangis germinen amb 6-8 zoospores, que, després d’un període de moviment, s’arrodoneixen, es cobreixen amb una closca i germinen amb un tub de brot. El brot penetra a través dels estomes fins al teixit foliar. En certes condicions, els esporangis poden créixer en un tub de creixement directament cap al teixit foliar. En condicions favorables, el temps des de la infecció fins a la formació de nova esporulació és de només 3-4 dies.
Un cop a terra i filtrats pel sòl, els esporangis són capaços d’infectar els tubercles. Els tubercles greument afectats es podreixen durant l’emmagatzematge; en els afectats dèbilment, la infecció pot persistir fins a la temporada següent. A més, l’agent causant del tizó tardà pot persistir a l’hivern en forma d’ospores (espores sexuals en repòs de parets gruixudes) al sòl sobre les restes vegetals i les llavors de tomàquet. Les òspores es formen als òrgans vius de les plantes quan les soques de diferents tipus d'aparellament es troben amb una humitat excessiva. A la primavera, es forma esporulació asexual als tubercles infectats plantats i als residus vegetals amb oospores; les zoospores entren al sòl i provoquen la infecció de les fulles inferiors de les plantes. En alguns casos, el miceli pot créixer des del tubercle infectat al llarg de la part verda de la planta i sol aparèixer a la part superior de la tija.
Una diferència significativa entre els oomicets i la majoria dels fongs rau en el predomini de la diplofase en el seu cicle de vida amb meiosi gamètica i germinació de zigots (oospores) sense fissió nuclear reductiva. Aquesta característica, més l’heterotallisme dipolar que substitueix la bisexualitat, semblaria permetre aplicar als oomicets els enfocaments desenvolupats per a l’estudi de les poblacions d’eucariotes superiors (anàlisi de panmixia i subdivisió de poblacions, fluxos de gens intra i interpoblació, etc.). No obstant això, tres factors no permeten transferir completament aquests enfocaments en l'estudi de les poblacions de P. infestans.
1. Juntament amb les oospores híbrides, es formen en les poblacions oospores autofèrtils i partenogenètiques (Fife i Shaw, 1992; Anikina et al., 1997a; Savenkova, Cherepnikoba-Anirina, 2002; Smirnov, 2003), i la freqüència de la seva formació pot ser suficient per influir sobre els resultats de les proves.
2. El procés sexual a P. infestans fa una contribució insignificant a la dinàmica de la mida de la població, perquè el fong es reprodueix principalment per espores vegetatives, formant més del 90% dels resultats de l'anàlisi del tipus d'aparellament pel mètode tradicional sobre un mitjà nutritiu ... la temporada de creixement diverses generacions d’esporulació asexual (desenvolupament de malalties policícliques). Les oospores tenen un paper important en la preservació de l'organisme durant el període en què no hi ha plantes verdes (a l'hivern) i en la infecció primària de les plàntules. Després, durant l’estiu, es produeix una reproducció clonal i un augment o, al contrari, una disminució del nombre de clons individuals que han sorgit com a conseqüència de la recombinació sexual, que es determina principalment per la selecció dels més adaptats. Per tant, la proporció de clons individuals en una població al començament i al final dels epifitòtics pot ser completament diferent.
3. El cicle descrit és característic de les poblacions natives de P. infestans a la seva terra natal, Amèrica Central. En altres zones del món, el procés sexual no es coneixia durant més de 100 anys; el miceli vegetatiu dels tubercles de patata infectats era l’etapa d’hivernada. El cicle de vida era completament agàmic i la propagació tenia una naturalesa central: la infecció dels tubercles plantats infectats sols passava a les fulles, formant els focus principals de la malaltia, que podrien fusionar-se amb el desenvolupament massiu de la malaltia.
Així, en algunes regions pot haver-hi una alternança de cicles sexuals i asexuals, mentre que en d’altres, només cicles asexuals.
Origen de P. INFESTANS
P. infestans va aparèixer a Europa a finals de la primera meitat del segle XIX. Atès que la patata és originària de la part nord-est de l’Amèrica del Sud, es va suposar que el paràsit es va portar d’aquí a Europa durant l’auge del salitre xilè. No obstant això, els estudis realitzats a l’estació de patates del Rockefeller Center a la vall de Toluca, Mèxic, van obligar a reconsiderar aquest punt de vista (Niederhauser, 1991, 1993).
1. A la vall del Toluca, les espècies locals de patates tuberoses (Solanum demissum, S. bulbocastanum, etc.) presenten diferents conjunts de gens de resistència vertical combinats amb un alt nivell de resistència inespecífica, cosa que indica una llarga co-evolució amb el paràsit. Les espècies sud-americanes, incloses les patates cultivades, no tenen gens de resistència.
2. A la vall de Toluca, es troben aïllats amb tipus d'aparellament A1 i A2, com a conseqüència dels quals la població mestissa de P. infestans és àmpliament estesa; mentre que a la terra natal de patates cultivades, a Amèrica del Sud, el paràsit es propaga clonalment.
3. A la vall del Toluca, hi ha epidèmies greus anuals de tizones tardanes. Per tant, entre els investigadors nord-americans (Universitat de Cornell), s’estableix l’opinió sobre Mesoamèrica (Amèrica Central) com a bressol de la phytophthora de la patata (Goodwin et al., 1994).
Els investigadors sud-americans no comparteixen aquesta opinió. Creuen que la patata cultivada i el seu paràsit P. infestans tenen una pàtria comuna: els Andes sud-americans. Van donar suport al seu punt de vista mitjançant estudis moleculars sobre l'anàlisi de polimorfismes d'ADN del genoma mitocondrial (ADNmt) i dels gens nuclears RAS i β-tubulina (Gomez-Alpizar et al., 2007). Van demostrar que les soques recollides de diferents parts del món descendien de tres línies ancestrals divergents que (les tres) es troben als Andes sud-americans. Els haplotips andins són descendents de dues línies: els aïllats del llinatge mtDNA més antic es troben a les Solanàcies de cultiu silvestre de la secció Anarrhicomenum a l’Equador, mentre que els aïllats de la segona línia són freqüents a les patates, els tomàquets i les mores de sol. A Toluca, fins i tot haplotips rars descendeixen d’un sol llinatge, amb la variabilitat genètica de les soques de Toluca (baixa freqüència al·lèlica d’alguns llocs variables) que indica un fort efecte fundador a causa de la deriva recent.
A més, es va trobar una nova espècie de P. andina als Andes, morfològicament i genèticament similar a P. infestans, que, segons els autors, apunta als Andes com un punt calent d’especiació al gènere Phytophthora. Finalment, a Europa i als Estats Units, les poblacions de P. infestans inclouen els dos llinatges andins, mentre que a Toluca només n’hi ha un.
Aquesta publicació va provocar la resposta d’un grup d’investigadors de diferents països, que van fer molta feina experimental per revisar l’estudi anterior (Goss et al., 2014). En aquest treball, en primer lloc, es van utilitzar seqüències de DNA de microsatèl·lits més informatives per estudiar polimorfismes d’ADN; en segon lloc, per a l’anàlisi de l’agrupació, camins migratoris, temps de divergència de poblacions, etc. es van utilitzar models més avançats (estadístiques F, aproximacions bayesianes, etc.) i, en tercer lloc, es va utilitzar una comparació no només amb l’espècie andina P. andina, en què es va establir una naturalesa híbrida (P. infestans x Phytophthora sp.) , però també amb les espècies endèmiques mexicanes P. mirabilis, P. Ipomoeae i Phytophthora phaseoli - genèticament properes a P. infestans pertanyents al mateix clade (Kroon et al., 2012). Com a resultat d’aquestes anàlisis, es va demostrar sense ambigüitats que la part arrel de l’arbre filogenètic de totes les espècies del gènere Phytophthora preses a l’estudi, a excepció de l’híbrid P. andina, pertany a soques mexicanes, i el flux migratori té la direcció Mèxic - Andes, i no viceversa, i el seu inici coincideix amb l’europeu colonització del Nou Món (fa 300-600 anys). Així, l’aparició de l’espècie de P. infestans, especialitzada en la derrota de les patates, es va produir al centre genètic secundari de la formació de solanaces tuberoses, és a dir a Amèrica Central.
Genoma de P. INFESTANS
El 2009, un equip internacional de científics va seqüenciar el genoma complet de P infestans (Haas et al, 2009), la mida del qual era de 240 MB. Això és diverses vegades més que en espècies estretament relacionades P. sojae (95 Mb), causant la podridura de les arrels de la soja i P. Ramorum (65 Mb), que afecten espècies d’arbres tan valuoses com el roure, el faig i algunes altres. Les dades obtingudes van mostrar que el genoma conté un gran nombre de còpies de seqüències repetides: un 74%. El genoma conté 17797 gens que codifiquen proteïnes, la majoria dels quals són gens implicats en processos cel·lulars, inclosa la replicació de l'ADN, la transcripció i la traducció de proteïnes.
Una comparació de genomes del gènere Phytophthora va revelar una organització inusual del genoma, que consisteix en blocs de seqüències de gens conservats, en què la densitat gènica és relativament alta i el contingut de seqüències repetides és relativament baixa, i regions individuals amb seqüències de gens no conservats, amb una baixa densitat gènica i un alt contingut de regions que es repeteixen. Els blocs conservadors representen el 70% (12440) de tots els gens que codifiquen les proteïnes de P. infestans. Dins dels blocs conservadors, els gens solen estar molt separats amb una distància intergènica mitjana de 604 pb. En zones entre blocs conservadors, la distància intergènica és major (3700 pb) a causa d’un augment de la densitat d’elements que es repeteixen. Els gens secretors efectors de ràpida evolució es localitzen en regions pobres en gens.
L’anàlisi de seqüències del genoma de P. Infestans va mostrar que aproximadament un terç del genoma pertany a elements transposables. El genoma de P. infestans conté famílies de transposons significativament més diferents que altres genomes coneguts. La majoria dels transposons de P. infestans pertanyen a la família gitana.
En el genoma de P. infestans, s’ha identificat un gran nombre de famílies de gens específics implicats en la patogènesi. Una part significativa d’elles codifica proteïnes efectores que canvien la fisiologia de la planta hoste i contribueixen a la seva infecció. Pertanyen a dues grans categories: els efectors apoplàstics, que actuen als espais intercel·lulars (apoplasts), i els efectors citoplasmàtics, que entren a les cèl·lules a través de l’austòria. Els efectors apoplàstics inclouen enzims hidrolítics secretats com proteases, lipases i glicosilases que destrueixen les cèl·lules vegetals; inhibidors dels enzims de defensa de les plantes hostes i toxines necrotitzants com proteïnes similars a Nep1 (NPL) i petites proteïnes riques en cisteïna (SCR) similars a Pcf.
Els gens efectors de P. infestans són nombrosos i solen ser més grans que els gens no patògens. Els més coneguts són els efectors citoplasmàtics RXLR i Crinkler (CNR). Els efectors citoplasmàtics típics dels oomicets són les proteïnes RXLR. Tots els gens efectors RXLR descoberts fins ara contenen el grup amino-terminal Arg-XLeu-Arg, on X és un aminoàcid. Com a resultat de l'estudi, es va suggerir que hi ha 563 gens RXLR al genoma de P. infestans, que és un 60% més que a P. sojae i P. ramorum. Aproximadament la meitat dels gens RXLR del genoma de P. infestans són específics de cada espècie. Els efectors RXLR tenen una gran varietat de seqüències. Entre elles, es van identificar una família nombrosa i 150 famílies petites. A diferència del proteoma principal, els gens efectors RXLR solen localitzar-se en regions del genoma pobres en gens i riques en repeticions. Els elements mòbils que determinen el dinamisme d’aquestes regions faciliten la recombinació d’aquests gens.
Els efectors CRN citoplasmàtics es van identificar originalment en transcripcions de P. infestans que codificaven pèptids de necrosi de teixits vegetals. Des del seu descobriment, s’ha sabut poc sobre la família d’aquests efectors. L’anàlisi del genoma de P. Infestans va revelar una enorme família de 196 gens CRN, que és molt més gran que la de P. sojae (100 CRN) i P. ramorum (19 CRN). Igual que els RXLR, les CRN són proteïnes modulars i consisteixen en un domini LFLAK N-terminal altament conservat (50 aminoàcids) i un domini DWL adjacent que conté diferents gens. La majoria de CRN (60%) posseeixen un pèptid senyal.
S'ha estudiat la possibilitat que diversos CRN interrompin els processos cel·lulars de la planta hoste. En l’anàlisi de la necrosi vegetal, l’eliminació de les proteïnes CRN2 va permetre identificar la regió C-terminal formada per 234 aminoàcids (posicions 173-407, domini DXG) i causar la mort cel·lular. L’anàlisi dels gens CRN de P. infestans va revelar quatre regions C-terminals diferents, que també causen la mort cel·lular a la planta. Aquests inclouen els dominis DC recentment identificats (P. Infestans té 18 gens i 49 pseudògens), així com els dominis D2 (14 i 43) i DBF (2 i 1) que són similars a les proteïnes quinases. Les proteïnes dels dominis CRN expressades en una planta es conserven (en absència de pèptids senyal) en una cèl·lula vegetal i estimulen la mort cel·lular mitjançant un mecanisme intracel·lular. És probable que altres 255 seqüències que continguin dominis CRN no funcionin com a gens.
L’increment del nombre i la mida de les famílies de gens efectors RXLR i CRN es deu probablement a la recombinació homòloga no al·lèlica i a la duplicació de gens. Tot i que el genoma conté un gran nombre d'elements mòbils actius, encara no hi ha proves directes de la transferència de gens efectors.
Mètodes utilitzats en l'estudi de l'estructura de la població
L’estudi de l’estructura genètica de les poblacions es basa actualment en l’anàlisi de cultius purs de les seves soques constitutives. L’anàlisi de les poblacions sense aïllar cultius purs també es realitza amb finalitats específiques, com, per exemple, estudiar l’agressivitat d’una població o la presència de soques resistents als fungicides (Filippov et al., 2004; Derevyagina et al., 1999). Aquest tipus de recerca implica l’ús de mètodes especials, la descripció dels quals està fora de l’abast d’aquesta revisió. Per a l’anàlisi comparativa de soques, s’utilitzen diversos mètodes, basats tant en l’anàlisi de l’estructura de l’ADN com en l’estudi de les manifestacions fenotípiques. L’anàlisi comparativa de les poblacions ha de fer front a un gran nombre d’aïllats, cosa que imposa certs requisits als mètodes utilitzats. Idealment, haurien de complir els requisits següents (Cooke, Lees, 2004, Mueller, Wolfenbarger, 1999):
- ser barat, fàcil d’implementar, no requereixen despeses de temps significatives, basar-se en tecnologies generalment disponibles (per exemple, PCR);
- Ha de generar un nombre prou gran de funcions de marcador codominant independents;
- tenen una alta reproductibilitat;
- utilitzar la quantitat mínima de teixit per examinar;
- ser específic del substrat (la contaminació present en el cultiu no hauria d’afectar els resultats);
- no requereixen l'ús de procediments perillosos i productes químics altament tòxics.
Malauradament, no hi ha mètodes que corresponguin a tots els paràmetres anteriors. Per a un estudi comparatiu de soques al nostre temps, s’utilitzen mètodes basats en l’anàlisi de trets fenotípics: virulència a varietats de patata i tomàquet (races de patates i tomàquets), tipus d’aparellament, espectres d’isoenzims de peptidasa i isomerasa de glucosa-6-fosfat, i en anàlisi de l’estructura de l’ADN: polimorfisme de longitud fragment de restricció (RFLP), que se sol complementar amb una sonda d’hibridació RG 57, anàlisi de repeticions de microsatèl·lits (SSR i InterSSR), amplificació amb primers aleatoris (RAPD), amplificació de fragments de restricció (AFLP), amplificació amb primers homòlegs a les seqüències d’elements mòbils (per exemple, Inter SINE PCR), determinació d’haplotips d’ADN mitocondrial.
Breu descripció dels mètodes d’estudi comparatiu de soques utilitzades en el treball amb P. Infestans
Trets del marcador fenotípic
Curses de "patates"
Les races de "patates" són un marcador que s'utilitza i s'utilitza habitualment. Les races de patates simples tenen un gen per a la virulència de la patata, les "complexes", com a mínim dues. Black et al. (1953), resumint totes les dades que tenien a l’abast, van trobar que la raça phytophthora és capaç d’infectar les plantes amb el gen / gens de resistència corresponents al gen / gens de virulència de P. infestans, i va trobar les races 1, 2, 3 i 4 que infecten les plantes amb els gens R1, R2, R3 i R4, respectivament, és a dir, la interacció entre el paràsit i l'hoste es produeix d'acord amb el principi del gen per al gen. A més, Black, amb la participació de Gallegly i Malcolmson, va descobrir els gens de resistència R5, R6, R7, R8, R9, R10 i R11, així com les races corresponents (Black, 1954; Black & Gallegly, 1957; Malcolmson & Black, 1966; Malcolmson, 1970).
Hi ha un ampli conjunt de dades sobre la composició racial del patogen de diferents regions. Sense analitzar aquestes dades en detall, només indicarem una tendència general: on es van utilitzar varietats amb nous gens de resistència o les seves combinacions, al principi es va produir un cert debilitament del tizó tardà, però després van aparèixer les races amb els gens de virulència corresponents i es van seleccionar els brots de tos tardà. La virulència específica contra els primers 4 gens de resistència (R1-R4) poques vegades es va observar a les col·leccions recollides abans de la introducció al cultiu de varietats amb aquests gens, però el nombre de soques virulentes va augmentar bruscament quan el patogen va parasitar les varietats que portaven aquests gens. Els gens 5-11, en canvi, eren força comuns a les col·leccions (Shaw, 1991).
Un estudi de la proporció de diferents races durant la temporada de creixement, realitzat a finals dels anys vuitanta, va demostrar que al començament del desenvolupament de la malaltia, predominen a la població clons amb baixa agressivitat i 1980-1 gens de virulència.
A més, amb el desenvolupament del tizó tardà, disminueix la concentració dels clons originals i augmenta el nombre de races "complexes" amb alta agressivitat. L’aparició d’aquests darrers al final de la temporada arriba al 100%. Quan s’emmagatzemen tubercles, es produeix una disminució de l’agressivitat i una pèrdua de gens de virulència individuals. La dinàmica de la substitució de clons es pot produir en diferents varietats de maneres diferents (Rybakova i Dyakov, 1990). No obstant això, els nostres estudis realitzats el 2000-2010 van demostrar que les races complexes es troben des del principi dels epifitòtics entre soques aïllades tant de patates com de tomàquets. Això es deu probablement a canvis en les poblacions de P. Infestans a Rússia.
El 1988-1995, la freqüència d'aparició de "superracies" amb tots o gairebé tots els gens de virulència en diferents regions va arribar al 70-100%. Aquesta situació es va observar, per exemple, a Bielorússia, a les regions de Leningrad, Moscou, a Osetia del Nord i a Alemanya (Ivanyuk et al., 2002a, 2002b; Politiko, 1994; Schober-Butin et al., 1995).
Curses de "tomàquet"
En els cultivars de tomàquet, només es van trobar 2 gens de resistència al tizó tardà: Ph1 (Gallegly i Marvell, 1955) i Ph2 (Al-Kherb, 1988). Com en el cas de les races de patates, la interacció entre els tomàquets i P. infestans es produeix de manera genètica. La raça T0 infecta varietats que no tenen gens de resistència (la majoria de varietats usades industrialment), la raça T1 infecta varietats amb el gen Ph1 (Ottawa) i la raça T2 infecta varietats amb el gen Ph2.
A Rússia, gairebé exclusivament, T0 es va trobar a les patates; El T0 predominava als tomàquets a principis de temporada, però posteriorment fou substituït per la carrera T1 (Dyakov et al., 1975, 1994). Després del 2000, el T1 de les patates en moltes poblacions va començar a produir-se al principi del període epifitòtic. Als Estats Units, les soques de patata no eren patògenes per al tomàquet, així com les races T0, T1 i T2, mentre que T1 i T2 prevalien sobre els tomàquets (Vartanian i Endo, 1985; Goodwin et al., 1995).
Tipus d'aparellament
Per dur a terme l'estudi, es requereixen soques provadores (de referència) amb tipus d'aparellament coneguts (A1 i A2). L'aïllat de prova s'inocula amb ells per parelles en plaques de Petri amb mitjà d'agar de civada. Després de la incubació durant 10 dies, les plaques s’examinen per a la presència o absència d’ospores al medi a la zona de contacte de les soques. Hi ha 4 opcions: la soca pertany al tipus d'aparellament A1, si forma oospores amb el provador A2, a A2, si forma oospores amb el provador A1, a A1A2, si forma oospores amb els dos provadors o és estèril (00), si no forma oospores sense provador (els dos darrers grups són rars).
Per determinar amb més rapidesa els tipus d’aparellament, es va intentar identificar les regions del genoma associades al tipus d’aparellament, amb l’objectiu de continuar utilitzant-les per determinar el tipus d’aparellament per PCR. Un dels primers experiments amb èxit per identificar aquest lloc va ser realitzat per investigadors nord-americans (Judelson et al., 1995). Mitjançant el mètode RAPD, van ser capaços d’identificar la regió W16 associada al tipus d’aparellament en la descendència de dos aïllats creuats i van dissenyar un parell de primers de 24 pb per a la seva amplificació (W16-1 (5’-AACACGCACAAGGCATATAAATGTA-3 ’) i W16-2 (5’) -GCGTAATGTAGCGTAACAGCTCTC-3 ') Després de la restricció del producte de PCR amb l'enzim de restricció HaeIII, va ser possible separar els aïllats amb els tipus d'aparellament A1 i A2.
Un altre intent d’obtenir marcadors de PCR per determinar els tipus d’aparellament el van dur a terme investigadors coreans (Kim, Lee, 2002). Van identificar productes específics mitjançant el mètode AFLP. Com a resultat, es van desenvolupar un parell de primers PHYB-1 (endavant) (5'-GATCGGATTAGTCAGACGAG-3 ') i PHYB-2 (5'-GCGTCTGCAAGGCGCATTTT-3'), que permeten l'amplificació selectiva de la regió del genoma associada a l'aparellament A2. Posteriorment, van continuar aquest treball i van dissenyar els primers 5 'AAGCTATACTGGGACAGGGT-3' (INF-1, endavant) i 5'-GCGTTCTTTCGTATTACCAC-3 '(INF-2), que permeten l'amplificació selectiva de la regió Mat-A1 característica de les soques amb tipus d'aparellament A1. L’ús del diagnòstic per PCR de tipus d’aparellament va mostrar bons resultats en l’estudi de les poblacions de P. infestans a la República Txeca (Mazakova et al., 2006), Tunísia (Jmour, Hamada, 2006) i altres regions. Al nostre laboratori (Mytsa, Elansky, inèdit), es van analitzar 34 soques de P. infestans aïllades d’òrgans de patata i tomàquet malalts a diferents regions de Rússia (Kostroma, Ryazan, Astrakhan, oblasts de Moscou). Els resultats de l’anàlisi de PCR mitjançant primers específics més del 90% van coincidir amb els resultats de l’anàlisi del tipus d’aparellament pel mètode tradicional en un mitjà nutritiu.
Taula 1. Variabilitat de la resistència dins del clon Sib 1 (Elansky et al., 2001)
Ubicació de la recollida de mostres | Nombre d’aïllats analitzats | Nombre de soques sensibles (S), dèbilment resistents (SR) i resistents (R), unitats (%) | ||
S | SR | R | ||
G. Vladivostok | 10 | 1 (10) | 4 (40) | 5 (50) |
G. Chita | 5 | 0 | 0 | 5 (100) |
Irkutsk | 9 | 9 (100) | 0 | 0 |
G. Krasnoyarsk | 13 | 12 (92) | 1 (8) | 0 |
Ciutat de Ekaterimburg | 15 | 8 (53) | 1 (7) | 6 (40) |
O. Sakhalin | 66 | 0 | 0 | 66 (100) |
Regió d'Omsk | 18 | 0 | 0 | 18 (100) |
La resistència al metalaxil com a marcador poblacional
A principis de la dècada de 1980, es van observar a diverses regions brots de brots tardans causats per soques de P. infestans resistents al metalaxil. Les granges de patates de molts països han patit pèrdues importants (Dowley i O'Sullivan, 1981; Davidse et al., 1983; Derevyagina, 1991). Des de llavors, a molts països del món, s’ha dut a terme un control constant de l’aparició de soques resistents a la fenilamida a les poblacions de P. infestans. A més d’una avaluació pràctica de les perspectives d’ús de fàrmacs que contenen fenilamida, la creació d’un sistema de mesures protectores i la predicció d’epifitoties, la resistència a aquests fàrmacs s’ha convertit en una de les característiques marcadores àmpliament utilitzades per a l’anàlisi comparativa de les poblacions d’aquest patogen. Tanmateix, l’ús de la resistència al metalaxil en estudis comparatius de població s’hauria de dur a terme tenint en compte que: 1 - la base genètica de la resistència encara no s’ha determinat amb precisió, 2 - la resistència al metalaxil és un tret selectivament dependent que pot variar en funció de l’ús de fenilamides, 3 - diferents el grau de sensibilitat a les soques de metalaxil dins d’una línia clonal (taula. 1).
Espectres d’isozims
Els marcadors d’isozims solen ser independents de les condicions externes, mostren herència mendeliana i són codominants, cosa que permet distingir entre homo i heterozigots. L’ús de proteïnes com a marcadors de gens permet identificar tant grans reorganitzacions del material genètic, incloses mutacions cromosòmiques i genòmiques, com substitucions d’aminoàcids individuals.
Els estudis electroforètics de proteïnes han demostrat que la majoria dels enzims existeixen en els organismes en forma de diverses fraccions que difereixen en la mobilitat electroforètica. Aquestes fraccions són el resultat de codificar múltiples formes d’enzims per diferents locis (isozims o isozims) o per diferents al·lels d’un mateix locus (alozims o aloenzims). És a dir, els isozims són diferents formes d’un enzim. Diferents formes tenen la mateixa activitat catalítica, però difereixen lleugerament en les substitucions individuals d’aminoàcids al pèptid i a càrrec. Aquestes diferències es revelen durant l’electroforesi.
Quan s’estudien les soques de P. infestans, s’utilitzen els espectres dels isoenzims de dues proteïnes, la peptidasa i la glucosa-6-fosfat isomerasa (aquest enzim és monomorf en les poblacions russes; per tant, els mètodes del seu estudi no es presenten en aquest treball). Per separar-los en isozims en un camp elèctric, s’apliquen preparacions de proteïnes aïllades dels organismes estudiats a una placa de gel col·locada en un camp elèctric. La velocitat de difusió de proteïnes individuals en el gel depèn de la càrrega i el pes molecular; per tant, en un camp elèctric, la barreja de proteïnes es separa en fraccions individuals, que es poden visualitzar utilitzant colorants especials.
L’estudi dels isoenzims de la peptidasa es duu a terme sobre gels d’acetat de cel·lulosa, midó o poliacrilamida. El més convenient és el mètode basat en l’ús de gels d’acetat de cel·lulosa fabricats per Helena Laboratories Inc. No requereix grans quantitats de materials de prova, permet obtenir bandes de contrast al gel després de l’electroforesi per a ambdós locis enzimàtics, la seva implementació no requereix grans costos de temps i material (Fig. 2).
Un petit tros de miceli es transfereix a un microtub d’1,5 ml i se li afegeixen 1-2 gotes d’aigua destil·lada. Després d'això, la mostra s'homogeneïtza (per exemple, amb un trepant elèctric amb un accessori de plàstic adequat per a un microtub) i es sedimenta durant 25 segons en una centrífuga a 13000 rpm. A 8 μl de cada microtub. el sobrenedant es transfereix a la placa aplicadora.
El gel d’acetat de cel·lulosa s’elimina del contenidor tampó, es traça entre dos fulls de paper de filtre i es col·loca amb la capa de treball sobre la base de plàstic de l’aplicador. La solució de la placa es transfereix per l'aplicador al gel 2-4 vegades. El gel es transfereix a una cambra d’electroforesi,
Taula 2. La composició de la solució utilitzada per tenyir gel d'acetat de cel·lulosa en l'anàlisi dels isoenzims de la peptidasa, es col·loca una gota de pintura (blau de bromofenol) a la vora del gel.
TRIS HCl, 0,05 M, Ph 8,0 2 ml
Peroxidasa, 1000 U / ml 5 gotes
o-dianisidina, 4 mg / ml 8 gotes
MgCl2, 20 mg / ml 2 gotes
Gly-Leu, 15 mg / ml 10 gotes
L-aminoàcid oxidasa, 20 u / ml 2 gotes
L’electroforesi es realitza durant 20 minuts. a 200 V. Després de l’electroforesi, el gel es transfereix a una taula de pintura i es pinta amb una solució especial de pintura (taula 2). Es fon fonamentalment 10 ml d’agar DIFCO a l’1,6% al forn de microones, es refreden a 60 ° C, després dels quals es barregen 2 ml d’agar amb una barreja de pintura i s’aboca sobre un gel. Les ratlles apareixen en un termini de 15-20 minuts. El reactiu L-aminoàcid oxidasa s’afegeix immediatament abans de barrejar la solució amb l’agar fos.
En les poblacions russes, el locus Pep 1 està representat pels genotips 100/100 i 92/100. L'homozigot 92/92 és extremadament rar (al voltant del 0,1%). Locus Rehr 2 està representat per tres genotips 100/100, 100/112 i 112/112, i les 3 variants són força habituals (Elanky i Smirnov, 2003, Fig. 2).
Investigació del genoma
Polimorfisme de longitud de fragment de restricció amb posterior hibridació (RFLP-RG 57)
L’ADN total es tracta amb un enzim de restricció Eco R1, els fragments d’ADN se separen mitjançant electroforesi en gel d’agarosa. L’ADN nuclear és molt gran i té moltes seqüències repetitives, cosa que dificulta l’anàlisi directa dels nombrosos fragments obtinguts per l’acció dels enzims de restricció. Per tant, els fragments d’ADN separats en el gel es transfereixen a una membrana especial i s’utilitzen per a la hibridació amb la sonda RG 57, que inclou nucleòtids marcats amb etiquetes radioactives o fluorescents. Aquesta sonda s’hibriditza amb seqüències genòmiques repetitives (Goodwin et al., 1992; Forbes et al., 1998). Després de visualitzar els resultats de la hibridació sobre un material lleuger o radioactiu, s’obté un perfil d’hibridació multi-locus (empremta digital), representat per 25-29 fragments (Forbes et al., 1998). La descendència assexual (clonal) tindrà els mateixos perfils. Per la disposició de les bandes en l’electroforetetograma, es pot jutjar les similituds i diferències dels organismes comparats.
Haplotips d’ADN mitocondrial
En la majoria de cèl·lules eucariotes, l’ADNmt es presenta en forma de molècula d’ADN circular de doble cadena, que, a diferència dels cromosomes nuclears de les cèl·lules eucariotes, es replica de forma semiconservadora i no s’associa amb molècules de proteïnes.
Es va seqüenciar el genoma mitocondrial de P. infestans i es van dedicar diversos treballs a l’anàlisi de les longituds de fragments de restricció (Carter et al, 1990; Goodwin, 1991; Gavino, Fry, 2002). Després que Griffith i Shaw (1998) desenvolupessin un mètode senzill i ràpid per determinar haplotips d'ADNmt, aquest marcador es va convertir en un dels més populars en els estudis de P. Infestans. L'essència del mètode consisteix en l'amplificació seqüencial de dos fragments d'ADN mitocondrial (del genoma comú) amb els primers F2-R2 i F4-R4 (Taula 3) i la seva posterior restricció amb els enzims de restricció MspI (primer fragment) i EcoR1 (1n fragment). El mètode permet identificar 2 haplotips: Ia, IIa, Ib, IIb. El tipus II es diferencia del tipus I per la presència d’una inserció de 4 pb de mida i per una ubicació diferent dels llocs de restricció a les regions P1881 i P2 (Fig. 4).
Des del 1996, entre les soques recollides al territori de Rússia, només es van observar els haplotips Ia i IIa (Elansky et al., 2001, 2015). Es poden identificar després de separar els productes de restricció amb la imprimació F2-R2 en un camp elèctric (Fig. 4, 5). Els tipus d’ADNmt s’utilitzen en l’anàlisi comparativa de soques i poblacions. En diversos estudis, es van utilitzar tipus d’ADN mitocondrial per aïllar línies clonals i passaportitzar aïllats de P. infestans (Botez et al., 2007; Shein et al., 2009). Mitjançant el mètode PCR-RFLP, es va concloure que l’ADNmt és heterogeni en la mateixa soca de P. infestans (Elansky i Milyutina, 2007). Condicions d'amplificació: 1x (500 seg. 94 ° C), 40x (30 seg. 90 ° C, 30 seg. 52 ° C, 90 seg. 72 ° C); 1x (5 min. 72 ° C). Mescla de reacció: (20 μl): 0,2 U Taq ADN polimerasa, 1x 2,5 mM tampó MgCl2-Taq 0,2 mM, 30 mM cada dNTP, 5 pM primer i 20 ng de l’ADN analitzat, aigua desionitzada - fins a XNUMX μl.
La restricció del producte PCR es duu a terme durant 4-6 hores a una temperatura de 37 ° C. Mescla de restricció (20 μl): 10x MspI (2 μl), tampó de restricció 10x (2 μl), aigua desionitzada (6 μl), producte de PCR (10 μl).
Taula 3. Imprimacions utilitzades per a l'amplificació de regions polimòrfiques d'ADNmt
Locus | Primer | Longitud i col·locació de la imprimació | Longitud del producte PCR | Restrictase |
---|---|---|---|---|
P2 | F2: 5'- TTCCCTTTGTCCTCTACCGAT | 21; 13619-13639 | 1070 | MspI |
R2: 5'- TTACGGCGGTTTAGCACATACA | 22; 14688-14667 | |||
P4 | F4: 5'- TGGTCATCCAGAGGTTTATGTT | 22; 9329-9350 | 964 | EcoRI |
R4:5 - CCGATACCGATACCAGCACCAA | 22; 10292-10271 |
Amplificació d’imprimació aleatòria (RAPD)
En dur a terme RAPD, s’utilitza un cebador (de vegades diversos cebadors simultàniament) amb una seqüència de nucleòtids arbitrària, generalment de 10 nucleòtids de longitud, amb un alt contingut (del 50%) de nucleòtids GC i una temperatura de recuit baixa (uns 35 ° C). Aquests primers "aterren" en nombrosos llocs complementaris del genoma. Després de l'amplificació, s'obté un gran nombre d'amplicons. El seu nombre depèn de la imprimació (s) utilitzada (s) i de les condicions de reacció (concentració de MgCl2 i temperatura de recuit).
La visualització dels amplicons es realitza mitjançant destil·lació en poliacrilamida o gel d’agarosa. Quan es realitzen anàlisis RAPD, és necessari controlar amb atenció la puresa del material analitzat, ja que la contaminació amb altres objectes vius pot causar un augment significatiu del nombre d’artefactes, que són força nombrosos en l’anàlisi de material pur (Perez et al, 1998). L’ús d’aquest mètode en l’estudi del genoma de P. infestans es reflecteix en molts treballs (Judelson, Roberts, 1999; Ghimire et al., 2002; Carlisle et al., 2001). La selecció de condicions de reacció i cebadors (es van estudiar 51 cebadors de 10 nucleòtids) es dóna a l'article per Abu-El Samen et al., (2003).
Anàlisi de repetició de microsatèl·lits (SSR)
Les repeticions de microsatèl·lits (repeticions de seqüències simples, SSR) són seqüències curtes repetides de forma conjunta de 1-3 (de vegades fins a 6) nucleòtids presents en els genomes nuclears de tots els eucariotes. El nombre de repeticions successives pot variar de 10 a 100. Els locus dels microsatèl·lits es produeixen amb una freqüència força alta i es distribueixen de manera més o menys uniforme per tot el genoma (Lagercrantz et al., 1993). El polimorfisme de seqüències de microsatèl·lits s’associa amb diferències en el nombre de repeticions del motiu bàsic. Els marcadors microsatèl·lits són codominants, cosa que permet utilitzar-los per analitzar l’estructura de la població, determinar el parentiu, les rutes de migració del genotip, etc. Entre altres avantatges d’aquests marcadors, cal destacar el seu alt polimorfisme, bona reproductibilitat, neutralitat i capacitat per realitzar anàlisis i avaluacions automàtiques. L’anàlisi del polimorfisme de repeticions de microsatèl·lits es realitza mitjançant amplificació PCR mitjançant primers complementaris de seqüències úniques que flanquegen els locus dels microsatèl·lits. Inicialment, l’anàlisi es realitzava amb la separació dels productes de reacció sobre un gel de poliacrilamida. Posteriorment, els empleats d’Appied Biosystems van proposar l’ús de cebadors marcats amb fluorescència amb detecció de productes de reacció mitjançant un detector làser automàtic (Diehl et al., 1990) i, a continuació, seqüenciadors automàtics d’ADN estàndard (Ziegle et al., 1992). L'etiquetatge dels primers amb diversos colorants fluorescents permet analitzar diversos marcadors alhora en un carril i, per tant, augmentar significativament la productivitat del mètode i augmentar la precisió de l'anàlisi.
Les primeres publicacions dedicades a l’ús de l’anàlisi SSR per a l’estudi de P. infestans van aparèixer a principis de la dècada de 2000. (Knapova, Gisi, 2002). No tots els marcadors proposats pels autors van mostrar un grau suficient de polimorfisme, però, dos d’ells (4B i G11) van ser inclosos en el conjunt de 12 marcadors SSR proposats per Lees et al. (2006) i adoptats posteriorment per la xarxa de recerca Eucablight (www.eucablight .org) com a estàndard per a P. infestans. Uns anys més tard, es va publicar un estudi sobre la creació d’un sistema d’anàlisi multiplex de l’ADN de P. infestans basat en vuit marcadors SSR (Li et al., 2010). Finalment, després d’avaluar tots els marcadors proposats anteriorment i seleccionar-ne els més informatius, a més d’optimitzar primers, etiquetes fluorescents i condicions d’amplificació, el mateix equip d’autors va presentar un sistema per a l’anàlisi multiplex d’un pas, incloent 12 marcadors (taula 4; Li et al. , 2013a). Els primers utilitzats en aquest sistema van ser seleccionats i etiquetats amb un dels quatre marcadors fluorescents (FAM, VIC, NED, PET) de manera que els intervals de les mides d’al·lels dels primers amb les mateixes etiquetes no es superposessin.
Els autors van realitzar l’anàlisi d’un amplificador PTC200 (MJ Research, EUA) mitjançant kits QIAGEN multiplex PCR o kits QIAGEN Typeit Microsatellite PCR. El volum de la mescla de reacció era de 12.5 μL. Les condicions d'amplificació van ser les següents: per a PCR multiplex QIAGEN: 95 ° C (15 min), 30x (95 ° C (20 s), 58 ° C (90 s), 72 ° C (60 s), 72 ° C (20 min); per QIAGEN Type-it Microsatellite PCR: 95 ° C (5 min), 28x (95 ° C (30 seg), 58 ° C (90 seg), 72 ° C (20 seg), 60 ° C (30 min).
La separació i visualització de productes de PCR es va realitzar mitjançant un analitzador automàtic d’ADN capil·lar ABI3730 (Applied Biosystems).
Taula 4. Característiques de 12 marcadors SSR estàndard utilitzats per genotipar P. Infestans (Li et al., 2013a)
Nom | Nombre d’al·lels | Rang de mides al·lels (bp) | Imprimacions |
PiG11 | 13 | 130-180 | F: NED-TGCTATTTATCAAGCGTGGG R: GTTTTCAATCTGCAGCCGTAAGA |
Pi02 | 4 | 255-275 | F: NED-ACTTGCAGAACTACCGCCC R: GTTTGACCACTTTCCTCCGGTTC |
PinfSSR11 | 4 | 325-360 | F: NED-TTAAGCCACGACATGAGCTG R: GTTTAGACAATTGTTTTGGGTCGC |
D13 | 16 | 100-185 | FAM-TGCCCCCTGCTCACTC R: GCTCGAATTCATTTTCAGACTTG |
PinfSSR8 | 4 | 250-275 | FAM-AATCTGATCGCAACTGAGGG R: GTTTACAAGATACACACGTCGCTCC |
PinfSSR4 | 7 | 280-305 | FAM-TCTTGTTCGAGTATGGGCGACG R: GTTTCACTTCGGGAGAAAGGCTTC |
Pi04 | 4 | 160-175 | F: VIC-AGCGGCTTTACCGATGG R: GTTTCAGCGGCTGTTTCGAC |
Pi70 | 3 | 185-205 | F: VIC-ATGAAAATACGTCAATGCTCG R: CGTTGGATATTTCTATTTCTTCG |
PinfSSR6 | 3 | 230-250 | F: GTTTTGGTGGGGCTGAAGTTTT R: VIC-TCGCCACAAGATTTATTCCG |
Pi63 | 3 | 265-280 | F: VIC-ATGACGAAGATGAAAGTGAGG R: CGTATTTTCCTGTTTATCTAACACC |
PinfSSR2 | 3 | 165-180 | F: PET-CGACTTCTACATCAACCGGC R: GTTGCTTGGACTGCGTCTTTAGC |
Pi4B | 5 | 200-295 | F: PET-AAAATAAAGCCTTTGGTTCA R: GCAAGGCGAGGTTTGTAGATT |
Un exemple de visualització dels resultats de l’anàlisi es mostra a la Fig. 6. Els resultats es van analitzar mitjançant el programari GeneMapper 3.7 comparant les dades obtingudes amb les dades dels aïllats coneguts. Per facilitar la interpretació dels resultats de l’anàlisi, cal incloure 1-2 aïllats de referència amb un genotip conegut en cada estudi.
El mètode de recerca proposat es va provar en un nombre significatiu de mostres de camp, després dels quals els autors van dur a terme l’estandardització de protocols entre laboratoris de dues organitzacions, l’Institut James Hutton (Regne Unit) i la Universitat i Investigació de Wageningen (Països Baixos), que, juntament amb la possibilitat d’utilitzar targetes FTA estàndard per simplificar la recollida i enviament de mostres d’ADN de P. infestans, va permetre parlar de la possibilitat d’un ús comercial d’aquest desenvolupament. A més, un mètode ràpid i precís de genotipatge d’aïllats de P. infestans mitjançant anàlisi SSR multiplex va permetre realitzar estudis estandarditzats de les poblacions d’aquest patogen a escala mundial i la creació d’una base de dades mundial sobre el tizó tardà en el marc del projecte Eucablight (www.eucablight.org), incloent , inclosos els resultats de l'anàlisi de microsatèl·lits, va permetre rastrejar l'aparició i la difusió de nous genotips a tot el món.
Polimorfisme de longitud de fragment de restricció amplificat (AFLP). AFLP (polimorfisme de longitud de fragment amplificat) és una tecnologia per generar marcadors moleculars aleatoris mitjançant primers específics. En AFLP, l’ADN es tracta amb una combinació de dos enzims de restricció. Els adaptadors específics estan lligats als extrems enganxosos dels fragments de restricció.
Aquests fragments s’amplifiquen a continuació mitjançant primers complementaris a la seqüència de l’adaptador i al lloc de restricció i porten addicionalment una o més bases aleatòries als seus extrems 3 ’. El conjunt de fragments obtinguts depèn d’enzims de restricció i de nucleòtids seleccionats aleatòriament als extrems 3 ’dels primers (Vos et al., 1995). El genotipatge AFLP s’utilitza per estudiar ràpidament la variació genètica de diversos organismes.
Una descripció detallada del mètode es dóna als treballs de Mueller, Wolfenbarger, 1999, Savelkoul et al., 1999. Molts treballs sobre la resolució dels mètodes AFLP i SSR han estat realitzats per investigadors xinesos. Es van estudiar les característiques fenotípiques i genotípiques de 48 aïllats de P. infestans recollits a cinc regions del nord de la Xina. Basant-se en espectres AFLP, es van identificar vuit genotips d'ADN diferents, en contrast amb els genotips SSR, per als quals no es va revelar cap diversitat (Guo et al., 2008).
Amplificació amb primers homòlegs a les seqüències d’elements mòbils
Els marcadors derivats de seqüències de retrotransposons són molt convenients per a la cartografia genètica, l’estudi de la diversitat genètica i els processos evolutius (Schulman, 2006). Si es fabriquen primers per complementar les seqüències estables de certs elements mòbils, és possible amplificar les regions del genoma situades entre ells. En estudis sobre l’agent causant del tizó tardà, es va utilitzar amb èxit el mètode d’amplificació de les regions del genoma mitjançant una imprimació complementària a la seqüència del nucli de la retroazona SINE (Short Intercaled Nuclear Elements) (Lavrova i Elansky, 2003). Mitjançant aquest mètode, es van revelar diferències fins i tot en la descendència asexual d’un aïllat. En aquest sentit, es va concloure que el mètode inter - SINE - PCR és molt específic i que la velocitat de moviment dels elements SINE en el genoma de Phytophthora és elevada.
En el genoma de P. infestans, s’han identificat 12 famílies de retrotransposons curts (SINE); es va investigar la distribució de les espècies de retrotransposons curts; es van identificar elements (SINE) que es troben al genoma de només P. infestans (Lavrova, 2004).
Característiques de l'aplicació de mètodes d'estudi comparatiu de soques en estudis de població
Quan planifiqueu un estudi, cal comprendre clarament els objectius que persegueix i utilitzar els mètodes adequats. Per tant, alguns mètodes permeten generar un gran nombre de característiques de marcador independents, però al mateix temps tenen una baixa reproductibilitat i depenen fortament dels reactius utilitzats, de les condicions de reacció i de la contaminació del material en estudi. Per tant, en cada estudi d’un grup de soques, és necessari utilitzar diversos aïllats estàndard (de referència), però fins i tot en aquest cas, els resultats de diversos experiments són molt difícils de combinar.
Aquest grup de mètodes inclou RAPD, AFLP, InterSSR, InterSINE PCR. Després de l'amplificació, s'obté un gran nombre de fragments d'ADN de diferents mides. Es recomana utilitzar aquestes tècniques quan és necessari establir diferències entre soques estretament relacionades (progenitors, mutants de tipus salvatge, etc.), o en els casos en què es requereixi una anàlisi detallada d’una mostra petita. Per tant, el mètode AFLP s’utilitza àmpliament en el mapatge genètic de P. infestans (van der Lee et al., 1997) i en estudis sobre intrapopulació (Knapova, Gisi, 2002, Cooke et al, 2003, Flier et al, 2003). Aquests mètodes són poc pràctics d'utilitzar quan es creen bases de dades de soques, ja que és pràcticament impossible unificar la comptabilitat dels resultats quan es realitzen anàlisis en diferents laboratoris.
Tot i l’aparent simplicitat i rapidesa d’execució (aïllament de l’ADN sense una bona purificació, amplificació, visualització dels resultats), aquest grup de mètodes requereix l’ús d’un mètode especial per documentar els resultats: destil·lació en gel de poliacrilamida amb primers marcats (radioactius o luminescents) i posterior exposició a la llum o material radioactiu. La imatge convencional del gel d’agarosa amb bromur d’etidi no sol ser adequada per a aquests mètodes perquè es poden fusionar un gran nombre de fragments d’ADN de diferents mides.
Altres mètodes, al contrari, permeten generar un nombre reduït de funcions amb una reproducibilitat molt alta. Aquest grup inclou l’estudi d’haplotips d’ADN mitocondrial (només hi ha dos haplotips Ia i IIa a Rússia), tipus d’aparellament (la majoria dels aïllats es subdivideixen en 2 tipus: A1 i A2, rarament es troba SF autofèrtil) i espectres d’isozima peptidasa (dos loci Pep1 i Pep2 , format per dos isozims cadascun) i glucosa-6-fosfat isomerasa (a Rússia no hi ha variabilitat per a aquest tret, tot i que es nota un polimorfisme significatiu en altres països del món). Es recomana utilitzar aquestes funcions a l’hora d’analitzar col·leccions, compilar bases de dades regionals i globals. En el cas de l’anàlisi d’isozims i haplotips d’ADN mitocondrial, és possible prescindir de les soques estàndard, mentre que en l’anàlisi dels tipus d’aparellament es requereixen dos aïllats de prova amb tipus d’aparellament coneguts.
Les condicions de reacció i els reactius només poden afectar el contrast del producte a l’electroforetograma; és poc probable que es manifestin artefactes en aquest tipus d’estudis.
Actualment, la majoria de les poblacions de la part europea de Rússia estan representades per soques d’ambdós tipus d’aparellament (taula 6), entre elles hi ha aïllats amb tipus Ia i IIa d’ADN mitocondrial (altres tipus d’ADNmt que es troben al món no s’han trobat a Rússia després del 1993). Els espectres dels isozims de la peptidasa estan representats per dos genotips al locus Pep1 (100/100, 92/92 i heterozigot 92/100, i el genotip 92/92 és extremadament rar (<0,3%)) i per dos genotips al locus Pep 2 (100/100 , 112/112 i heterozigot 100/112, amb el genotip 112/112 que es produeix amb menys freqüència que 100/100, però també amb força freqüència).
No hi va haver variabilitat en l’espectre d’isozims de glucosa-6-fosfat isomerasa després del 1993 (desaparició de la línia clonal US-1); tots els aïllats estudiats tenien el genotip 100/100 (Elansky i Smirnov, 2002).
El tercer grup de mètodes permet obtenir un grup suficient de característiques de marcador independents amb alta reproductibilitat. Avui, aquest grup inclou la sonda RFLP-RG57, que produeix de 25 a 29 fragments d’ADN de diferents mides. RFLP-RG57 es pot utilitzar tant en analitzar mostres com en compilar bases de dades. Tot i això, aquest mètode és molt més car que els anteriors, requereix molt de temps i requereix una quantitat prou gran d’ADN altament purificat. Per tant, l’investigador es veu obligat a limitar el volum del material provat.
El desenvolupament de RFLP-RG57 a principis dels anys noranta del segle passat va intensificar significativament els estudis sobre la població de l’agent causant del tizó tardà. Es va convertir en la base del mètode basat en la selecció i anàlisi de les "línies clonals" (vegeu més avall). Juntament amb RFLP-RG90, s’utilitzen tipus d’aparellament, empremta digital d’ADN (mètode RFLP-RG57), espectres de isoenzims de peptidasa i glucosa-57-fosfat isomerasa i tipus d’ADN mitocondrial per identificar línies clonals. Gràcies a ell, es va demostrar al., 6), la substitució de poblacions antigues per noves (Drenth et al, 1994, Sujkowski et al, 1993, Goodwin et al, 1994a), va revelar línies clonals imperants a molts països del món. Els estudis de soques russes mitjançant aquest mètode van mostrar un alt polimorfisme genotípic de les soques de la part europea i un monomorfisme de les poblacions de les parts asiàtiques i de l’extrem orient de Rússia (Elansky et al, 1995). I ara aquest mètode continua sent el principal en els estudis de població de P. infestans. No obstant això, la seva àmplia distribució es veu obstaculitzada pel cost i la intensitat laboral força elevats en l'execució.
Una altra tècnica prometedora que rarament s’utilitza en estudis de P. infestans és l’anàlisi de la repetició de microsatèl·lits (SSR). Actualment, aquest mètode s’utilitza àmpliament per aïllar línies clonals. Per a l’anàlisi de soques, es van utilitzar àmpliament (i es continuen utilitzant) trets de marcadors fenotípics com la presència de gens de virulència per a varietats de patates (Avdey, 1995; Ivanyuk et al., 2002; Ulanova et al., 2003) i el tomàquet. A hores d’ara, els gens de virulència a les varietats de patata han perdut el seu valor com a trets marcadors per als estudis de població a causa de l’aparició del nombre màxim (o proper) de gens de virulència a la gran majoria d’aïllats. Al mateix temps, el gen de virulència T1 per als cultivars de tomàquet que porten el gen Ph1 corresponent encara s’utilitza amb èxit com a tret marcador (Lavrova et al., 2003; Ulanova et al., 2003).
En molts estudis, la resistència a fungicides s'utilitza com a marcador. Aquest tret no és desitjable en estudis poblacionals a causa de l'aparició bastant fàcil de mutacions de resistència en línies clonals després de l'aplicació de fungicides que contenen metalaxil (o mefenoxam) al camp. Per exemple, es van mostrar diferències significatives en el nivell de resistència dins de la línia clonal Sib1 (Elansky et al., 2001).
Per tant, el tipus d’aparellament, l’espectre de l’isoenzim de la peptidasa, el tipus d’ADN mitocondrial, RFLP-RG57, SSR són les característiques preferides del marcador per crear bancs de dades i etiquetar soques a les col·leccions. Per comparar mostres limitades, si és necessari utilitzar el nombre màxim de funcions de marcador, podeu utilitzar AFLP, RAPD, InterSSR, Inter-SINE PCR (Taula 5). Tot i així, cal recordar que aquests mètodes són poc reproduïbles i, en cada experiment individual (cicle d’electroforesi d’amplificació), s’han d’utilitzar diversos aïllats de referència.
Taula 5. Comparació de diferents mètodes de recerca de soques P. infestans
criteri | Vehicle | Policia Isofer | ADNm | RFLP-RG57 | RAPD | ISSR | SSR | AFLP | Rev |
---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|
Quantitat d'informació | Н | Н | Н | С | В | В | С | В | В |
Reproducibilitat | В | В | В | В | Н | Н | С | С | С |
Possibilitat d’artefactes | Н | Н | Н | Н | В | С | Н | С | В |
Cost | Н | С | Н | В | Н | Н | Н | С | Н |
Intensitat laboral | Н | Н | Н | В | NS * | NS * | Н | С | NS * |
Velocitat d'anàlisi ** | В | Н | Н | С | Н | Н | Н | Н | Н |
Nota: H - baixa, C - mitjana, B - alta; НС *: la intensitat del treball és baixa quan s’utilitza gel d’agarosa o automàtic
genotipador, mitjà - per destil·lació en gel de poliacrilamida amb primers marcats,
** - sense comptar el temps dedicat al cultiu de miceli per a l'aïllament de l'ADN.
Estructura de la població
Línies clonals
En absència de recombinació o la seva insignificant contribució a l'estructura de la població, la població consisteix en un cert nombre de clons, els intercanvis genètics entre els quals són extremadament rars.
En aquestes poblacions, és més informatiu estudiar no les freqüències de gens individuals, sinó les freqüències de genotips que tenen un origen comú (línies clonals o llinatges clonals) i que difereixen només en mutacions puntuals. Els estudis de població del patogen de la tizona tardana i l’anàlisi de les línies clonals s’han accelerat significativament des de l’aparició del mètode RFLP-RG57 a principis dels anys 90 del segle passat. Juntament amb RFLP-RG57, s’utilitzen tipus d’aparellament, espectres de peptidasa i isoenzims de glucosa-6-fosfat isomerasa i tipus d’ADN mitocondrial per identificar línies clonals. Les característiques de les línies clonals més comunes es mostren a la taula 6.
El clon US-1 va dominar les poblacions d’arreu fins a finals dels anys vuitanta, després de la qual cosa va començar a ser substituït per altres clons i va desaparèixer d’Europa i Amèrica del Nord. Ara es troba a l’extrem orient (Filipines, Taiwan, Xina, Japó, Corea, Koh et al., 80, Mosa et al, 1994), a l’Àfrica (Uganda, Kenya, Rwanda, Goodwin et al, 1993, Vega-Sanchez et. al., 1994; Ochwo et al., 2000) i a Amèrica del Sud (Equador, Brasil, Perú, Forbes et al., 2002; Goodwin et al., 1997). No s’han identificat soques pertanyents a la línia US-1994 només a Austràlia. Pel que sembla, els aïllats de P. infestans van arribar a Austràlia amb una altra onada migratòria (Goodwin, 1).
El clon US-6 va migrar del nord de Mèxic a Califòrnia a finals dels anys setanta i va causar-hi una epidèmia de patates i tomàquets després de 70 anys sense malaltia. A causa de la seva gran agressivitat, va suplantar el clon US-32 i va començar a dominar a la costa oest dels Estats Units (Goodwin et al., 1a).
Els genotips US-7 i US-8 es van descobrir als Estats Units el 1992 i ja el 1994 es van distribuir àmpliament als Estats Units i al Canadà. Durant una temporada de camp, el clon US-8 és capaç de desplaçar gairebé completament el clon US-1 en parcel·les de patates inicialment infectades amb els dos clons a una concentració igual (Miller i Johnson, 2000).
Els clons BC-1 a BC-4 s’han identificat a la Columbia Britànica en un petit nombre d’aïllats de Goodwin et al., 1995b). El clon US-11 es va estendre àmpliament als Estats Units i va substituir l’US-1 a Taiwan. Els clons JP-1 i EC-1, juntament amb el clon US-1, són habituals al Japó i a l’Equador, respectivament (Koh et al., 1994; Forbes et al., 1997).
SIB-1 és un clon que va prevaler a Rússia sobre un vast territori des de la regió de Moscou fins a Sakhalin. A la regió de Moscou, es va descobrir el 1993 i algunes poblacions de camp consistien principalment en soques d'aquesta línia clonal, altament resistents al metalaxil. Després de 1993, la prevalença d’aquest clon va disminuir significativament. Fora dels Urals el 1997-1998, SIB-1 es va trobar a tot arreu, a excepció del territori de Khabarovsk (el clon SIB-2 hi és molt estès). La separació espacial de clons amb diferents tipus d'aparellament exclou el procés sexual a Sibèria i a l'Extrem Orient. A la regió de Moscou, a diferència de Sibèria, la població està representada per molts clons; gairebé tots els aïllats tenen un genotip multilocus únic (Elansky et al., 2001, 2015). Aquesta diversitat no es pot explicar únicament per la importació de soques del fong de diferents parts del món amb material de llavors importat. Atès que tots dos tipus d'aparellament es produeixen a la població, és possible que la seva diversitat també es degui a la recombinació. Així, a la Colúmbia Britànica s’assumeix l’aparició dels genotips BC-2, BC-3 i BC-4 a causa de la hibridació dels clons BC-1 i US-6 (Goodwin et al., 1995b). És possible que les soques híbrides es trobin a les poblacions de Moscou. Per exemple, les soques MO-4, MO-8 i MO-11 heterozigotes per al locus PEP poden ser híbrides entre les soques MO-12, MO-21, MO-22, que tenen el tipus d'aparellament A2 i homozigotes per a un al·lel del locus PEP i la soca MO-8, que té el tipus d'aparellament A1 i homocigot per a l'altre al·lel del locus. I si això és així, i en les poblacions modernes de P. infestans hi ha una tendència a un augment del paper del procés sexual, el valor de la informació de l’anàlisi de clons multilocus disminuirà (Elansky et al., 2001, 2015).
Variació en línies clonals
Fins a la dècada dels 90 del segle XX, la línia clonal US-20 estava estesa al món. La majoria de les poblacions de camp i regionals consistien exclusivament en soques amb el genotip US-1. No obstant això, també es van observar diferències entre aïllats, probablement causades per un procés mutacional. Les mutacions es van produir tant en l’ADN nuclear com en el mitocondrial i van afectar, entre altres coses, el nivell de resistència als medicaments fenilamidics i el nombre de gens de virulència. Les línies que difereixen dels genotips originals per mutacions s’indiquen amb números addicionals després del punt que segueix el nom del genotip original (per exemple, la línia mutant US-1 de la línia clonal US-1.1). Les línies d’ADN d’empremta digital US-1 i US-1.5 contenen línies accessòries de diferents mides (Goodwin et al., 1.6a, 1995b); la línia clonal US-1995 també difereix de la EUA-6.3 en una línia d'accessoris (Goodwin, 6, taula 1997).
En l'estudi de l'ADN mitocondrial, es va trobar que només l'ADN mitocondrial de tipus 1b es troba a la línia clonal US-1 (Carter et al., 1990). Tanmateix, en l’estudi de soques d’aquest llinatge clonal del Perú i les Filipines, es van trobar aïllats els tipus d’ADN mitocondrial dels quals diferien de 1b en presència d’insercions i deleccions (Goodwin, 1991; Koh et al., 1994).
Taula 6. Genotips multilocus d'algunes línies clonals de P. infestans
Nom | Tipus d'aparellament | Isozims | Empremtes digitals d’ADN | Tipus d’ADNm | |
GPI | PEP | ||||
US-1 | A1 | 86/100 | 92/100 | 1.0111010110011E + 24 | Ib |
US-2 | A1 | 86/100 | 92/100 | 1.0111010010011E + 24 | - |
US-3 | A1 | 86/100 | 92/100 | 1.0111000000011E + 24 | - |
US-4 | A1 | 100/100 | 92/92 | 1.0111010010011E + 24 | - |
US-5 | A1 | 100/100 | 92/100 | 1.0111010010011E + 24 | - |
US-6 | A1 | 100/100 | 92/100 | 1.0111110010011E + 24 | IIb |
US-7 | A2 | 100/111 | 100/100 | 1.0011000010011E + 24 | Ia |
US-8 | A2 | 100/111/122 | 100/100 | 1.0011000010011E + 24 | Ia |
US-9 | A1 | 100/100 | 83/100 | * | - |
US-10 | A2 | 111/122 | 100/100 | - | - |
US-11 | A1 | 100/111 | 92/100 | 1.0101110010011E + 24 | IIb |
US-12 | A1 | 100/111 | 92/100 | 1.0001000010011E + 24 | - |
US-14 | A2 | 100/122 | 100/100 | 1.0000000000011E + 24 | - |
US-15 | A2 | 100/100 | 92/100 | 1.0001000010011E + 24 | Ia |
US-16 | A1 | 100/111 | 100/100 | 1.0001100010011E + 24 | - |
US-17 | A1 | 100/122 | 100/100 | 1.0100010000011E + 24 | - |
US-18 | A2 | 100/100 | 92/100 | 1.0001000010011E + 24 | Ia |
US-19 | A2 | 100/100 | 92/100 | 1.0101010000011E + 24 | Ia |
EC-1 | A1 | 90/100 | 96/100 | 1.1111010010011E + 24 | IIa |
SIB-1 | A1 | 100/100 | 100/100 | 1.0001000110011E + 24 | IIa |
SIB-2 | A2 | 100/100 | 100/100 | 1.0001000010011E + 24 | IIa |
SIB-3 | A1 | 100/100 | 100/100 | 1.1001010100011E + 24 | IIa |
MO-1 | A2 | 100/100 | 100/100 | 1.0001000110011E + 24 | IIa |
MO-2 | A2 | 100/100 | 100/100 | 1.0001000010011E + 24 | Ia |
MO-3 | A1 | 100/100 | 100/100 | 1.0101000010011E + 24 | IIa |
MO-4 | A1 | 100/100 | 92/100 | 1.0101110110011E + 24 | IIa |
MO-5 | A1 | 100/100 | 100/100 | 1.0001010010011E + 24 | IIa |
MO-6 | A1 | 100/100 | 100/100 | 1.0101010010011E + 24 | Ia |
MO-7 | A1 | 100/100 | 92/100 | 1.0001000110011E + 24 | IIa |
MO-8 | A1 | 100/100 | 92/92 | 1.0101100010011E + 24 | IIa |
MO-9 | A1 | 100/100 | 92/100 | 1.0001000010011E + 24 | IIa |
MO-10 | A1 | 100/100 | 100/100 | 1.0101100000011E + 24 | Ia |
MO-11 | A1 | 100/100 | 92/100 | 1.0101010010011E + 24 | Ia |
MO-12 | A2 | 100/100 | 100/100 | 1.0101010010011E + 24 | Ia |
MO-13 | A1 | 100/100 | 100/100 | 1.0101010000011E + 24 | Ia |
MO-14 | A1 | 100/100 | 100/100 | 1.01010010011E + 22 | Ia |
MO-15 | A1 | 100/100 | 100/100 | 1.101110010011E + 23 | Ia |
MO-16 | A1 | 100/100 | 100/100 | 1.0001000000011E + 24 | IIa |
MO-17 | A1 | 86/100 | 100/100 | 1.0101010110011E + 24 | Ib |
MO-18 | A1 | 100/100 | 100/100 | 1.0101110010011E + 24 | IIa |
MO-19 | A1 | 100/100 | 100/100 | 1.0101010000011E + 24 | IIa |
MO-20 | A2 | 100/100 | 100/100 | 1.0101010000011E + 24 | IIa |
MO-21 | A2 | 100/100 | 100/100 | 1.0101010000011E + 24 | IIa |
Nota: *: no hi ha dades.
Taula 7. Genotips multilocus i les seves línies mutants
Nom | Tipus d'aparellament | | Empremtes digitals d’ADN (RG57) | Notes | |
GPI | PEP-1 | ||||
US-1 | A1 | 86/100 | 92/100 | 1011101011001101000110011 | Genotip original 1 |
US-1.1 | A1 | 86/100 | 100/100 | 1011101011001101000110011 | Mutació en PEP |
US-1.2 | A1 | 86/100 | 92/100 | 1011101010001101000110011 | Mutació a RG57 |
US-1.3 | A1 | 86/100 | 92/100 | 1011101001001101000110011 | Mutació a RG57 |
US-1.4 | A1 | 86/100 | 100/100 | 1011101010001101000110011 | Mutació en RG57 i PEP |
US-1.5 | A1 | 86/100 | 92/100 | 1011101011001101010110011 | Mutació a RG57 |
US-6 | A1 | 100/100 | 92/100 | 1011111001001100010110011 | Genotip original 2 |
US-6.1 | A1 | 100/100 | 92 /92 | 1011111001001100010110011 | Mutació en PEP |
US-6.2 | A1 | 100/100 | 92/100 | 1011101001001100010110011 | Mutació a RG57 |
US-6.3 | A1 | 100/100 | 92/100 | 1011111001011100010110011 | Mutació a RG57 |
US-6.4 | A1 | 100/100 | 100/100 | 1011011001001100010110011 | Mutació en RG57 i PEP |
US-6.5 | A1 | 100/100 | 92/100 | 1011111001001100010010011 | Mutació a RG57 |
BR-1 | A2 | 100/100 | 100/100 | 1011101000001100001111011 | Genotip original 3 |
BR-1.1 | A2 | 100/100 | 100/100 | 1010101000001100001110011 | Mutació a RG57 |
També hi ha canvis en els espectres dels isozims. Com a regla general, són causades per la descomposició d’un organisme inicialment heterozigot d’aquest enzim en homozigots. El 1993, en fruites de tomàquet, vam identificar una soca amb característiques típiques de l’US-1: empremta digital RG57, tipus d’ADN mitocondrial i genotip 86/100 per a la glucosa-6-fosfatizomerasa, però era homocigota (100/100) per al primer locus de la peptidasa en lloc de un heterozigot 92/100 típic d’aquesta línia clonal. Vam anomenar el genotip d’aquesta soca MO-17 (taula 6). Les línies mutants US-1.1 i US-1.4 també difereixen de US-1 per mutacions al primer locus de la peptidasa (taula 7).
Les mutacions que condueixen a canvis en el nombre de gens de virulència per a les varietats de patata i tomàquet són força freqüents. Es van assenyalar entre aïllats de la línia clonal US-1 en poblacions dels Països Baixos (Drenth i altres, 1994), Perú (Goodwin i altres, 1995a), Polònia (Sujkowski i altres, 1991), nord d’Amèrica del Nord (Goodwin i altres, ., 1995b). També es van observar diferències en el nombre de gens de virulència de la patata entre els aïllats de les línies clonals US-7 i US-8 al Canadà i els Estats Units (Goodwin et al., 1995a), entre els aïllats de la línia SIB-1 a la part asiàtica de Rússia (Elansky et al, 2001 ).
Es van identificar aïllats amb fortes diferències en els nivells de resistència a medicaments amb fenilamides en poblacions de camp monoclonal, totes pertanyents a la línia clonal Sib-1 (Elansky et al, 2001, taula 1). Gairebé totes les soques de la línia clonal US-1 són altament susceptibles al metalaxil; no obstant això, aïllats molt resistents d’aquesta línia es van aïllar a Filipines (Koh et al., 1994) i a Irlanda (Goodwin et al., 1996).
Població moderna de P. infestans
Amèrica Central (Mèxic)
La població de P. infestans a Mèxic difereix notablement d’altres poblacions mundials, cosa que es deu principalment a la seva posició històrica. Nombrosos estudis d’aquesta població i espècies relacionades amb P. infestans del clade Phytophthora, així com espècies locals del gènere Solanum, van portar a la conclusió que l’evolució del patogen a la part central de Mèxic es va produir juntament amb l’evolució de les plantes hostes i es va associar a la recombinació sexual (Grünwald, Flier , 2005). Els dos tipus d’aparellament es representen a la població, i en proporcions iguals, i la presència d’ospores al sòl, en plantes i tubercles de patates i espècies de Solanum relacionades amb la natura confirma la presència d’un procés sexual a la població (Fernández-Pavía et al., 2002). Estudis recents sobre la vall de Toluca i els seus voltants (el presumpte centre d’origen del patogen) van confirmar l’elevada diversitat genètica de la població local de P. infestans (134 genotips multilocus en una mostra de 176 mostres) i la presència de diverses subpoblacions diferenciades a la regió (Wang et al., 2017). Els factors que contribueixen a aquesta diferenciació són la divisió espacial de les subpoblacions característiques de les terres altes del centre de Mèxic, les diferències en les condicions de cultiu i les varietats de patata utilitzades a les valls i les muntanyes i la presència d’espècies de Solanum tuberoses silvestres que poden actuar com a hostes alternatives (Fry et al. ., 2009).
Tot i això, cal assenyalar que les poblacions de P. infestans al nord de Mèxic són més aviat clonals i més semblants a les poblacions nord-americanes, cosa que pot indicar que aquests són els nous genotips (Fry et al., 2009).
Amèrica del Nord
Les poblacions nord-americanes de P. infestans sempre han tingut una estructura molt simple i el seu caràcter clonal es va establir molt abans de l’ús de l’anàlisi de microsatèl·lits. Fins al 1987, la línia clonal US-1 dominava als Estats Units i al Canadà (Goodwin et al., 1995). A mitjan anys setanta, quan van aparèixer fungicides a base de metalaxil, aquest clon es va començar a substituir per altres genotips més resistents que van migrar des de Mèxic (Goodwin et al., 70). A finals dels anys 1998. el genotip US-90 va substituir completament el genotip US-8 als Estats Units i es va convertir en la línia clonal dominant de les patates (Fry et al., 1; Fry et al., 2009). La situació era diferent amb els tomàquets, que contenien constantment diverses línies clonals, i la seva composició va canviar d’any en any (Fry et al., 2015).
El 2009, als Estats Units va esclatar una epidèmia a gran escala de tizones tardanes sobre els tomàquets. Una característica d’aquesta pandèmia va ser l’aparició gairebé simultània a molts llocs del nord-est dels Estats Units i va resultar estar associada a vendes massives de plàntules de tomàquet infectades en grans centres de jardineria (Fry et al., 2013). Les pèrdues de collites van ser enormes. L’anàlisi de microsatèl·lits de les mostres afectades va revelar que la soca pandèmica pertanyia a la línia clonal d’aparellament tipus US-22 A2. El 2009, la proporció d’aquest genotip a la població nord-americana de P. infestans va arribar al 80% (Fry et al., 2013). En els anys següents, la proporció de genotips agressius US-23 (principalment en tomàquets) i US-24 (en patates) va augmentar constantment a la població, però, després del 2011, la taxa de detecció dels EUA-24 va disminuir significativament i, fins a la data, al voltant del 90% de la població patògena a Els Estats Units estan representats pel genotip US-23 (Fry et al., 2015).
Al Canadà, com als Estats Units, a finals dels anys 90. el genotip dominant US-1 va ser suplantat per US-8, la posició dominant de la qual va romandre inalterada fins al 2008. El 2009-2010. Al Canadà, hi va haver greus epidèmies de tardo tardà associades a la venda de plàntules de tomàquet infectades, però van ser causades pels genotips US-23 i US-8 (Kalischuk et al., 2012). La clara diferenciació geogràfica d'aquests genotips va ser notable: els EUA-23 van dominar les províncies occidentals del Canadà (68%), mentre que els EUA-8 van dominar les províncies orientals (83%). En els anys següents, els EUA-23 es van estendre a les regions orientals; però, en general, la seva participació en la població va disminuir lleugerament en el context de l’aparició dels genotips US-22 i US-24 al país (Peters et al., 2014). Fins ara, els EUA-23 mantenen una posició dominant a tot Canadà; Els EUA-8 són presents a la Colúmbia Britànica, mentre que els EUA-23 i els EUA-24 són presents a Ontario (Peters, 2017).
Així, les poblacions nord-americanes de P. infestans són principalment línies clonals. Durant els darrers 40 anys, el nombre de genotips clonals detectats ha arribat a 24. Tot i que hi ha ceps de tots dos tipus d’aparellament a la població, la probabilitat d’aparició de nous genotips com a resultat de la recombinació sexual continua sent força baixa. No obstant això, en els darrers 20 anys, s’han registrat diversos casos d’aparició de poblacions efímeres recombinants (Gavino et al., 2000; Danies et al., 2014; Peters et al., 2014) i, en un cas, el resultat de l’encreuament va ser el genotip US-11. , que va estar arrelada a Amèrica del Nord durant molts anys (Gavino et al., 2000). Fins al 2009, els canvis en l'estructura de les poblacions es van associar amb l'aparició de nous genotips més agressius amb la seva posterior migració i desplaçament dels predecessors anteriorment dominants. Què va passar el 2009-2010 Als EUA i al Canadà, els epifitòtics van demostrar per primera vegada que a l’era de la globalització, els brots de la malaltia es poden associar a la propagació activa de nous genotips en vendre material de plantació infectat.
Amèrica del Sud
Fins fa poc, els estudis sobre les poblacions sud-americanes de P. infestans no eren ni regulars ni a gran escala. Se sap que l’estructura d’aquestes poblacions és bastant senzilla i inclou d’1-5 llinatges clonals per país (Forbes et al., 1998). Així, el 1998 es van trobar a la patata els genotips US-1 (Brasil, Xile) BR-1 (Brasil, Bolívia, Uruguai, Paraguai), EC-1 (Equador, Colòmbia, Perú i Veneçuela), AR-1, AR -2, AR-3, AR-4 i AR-5 (Argentina), PE-3 i PE-7 (sud del Perú). L’aparellament tipus A2 era present al Brasil, Bolívia i Argentina i no es va trobar més enllà de la frontera boliviano-peruana a la zona del llac Titicaca, darrere del qual el genotip EC-1 A1 dominava als Andes. Pel que fa als tomàquets, US-1 va continuar sent el genotip dominant a tota Amèrica del Sud.
La situació va persistir més o menys als anys 2000. Un punt important va ser el descobriment als Andes del Nord sobre els parents de patates de cultiu silvestre (S. brevifolium i S. tetrapetalum) d’una nova línia clonal EC-2 del tipus A2 (Oliva et al., 2010). Els estudis filogenètics han demostrat que aquesta línia no és completament idèntica a P. infestans, tot i que hi està estretament relacionada, en relació amb la qual es va proposar considerar-la, així com una altra línia, EC-3, aïllada de l’arbre del tomàquet S. betaceum que creix als Andes, una nova espècie anomenada P. andina; tanmateix, l’estat d’aquesta espècie (una espècie independent o un híbrid de P. infestans amb alguna línia encara desconeguda) encara no està clar (Delgado et al., 2013).
Actualment, totes les poblacions sud-americanes de P. infestans són clonals. Tot i la presència d’ambdós tipus d’aparellament, no s’han identificat poblacions recombinants. En el cas dels tomàquets, el genotip US-1 és omnipresent, aparentment desplaçat de les patates per les soques locals, l’origen exacte del qual encara es desconeix. Al Brasil, Bolívia i Uruguai, el genotip BR-1 és present; al Perú, juntament amb US-1 i EC-1, hi ha diversos altres genotips locals. Als Andes, la posició dominant es manté per la línia clonal EC-1, la relació de la qual amb la recentment descoberta P. andina roman inexplorada. L'únic lloc "inestable" on va per al període 2003-2013. hi va haver canvis significatius en la població, es va convertir a Xile (Acuña et al., 2012), on el 2004-2005. la població de patògens es va caracteritzar per la resistència al metalaxil i un nou haplotip d'ADN mitocondrial (Ia en lloc de l'Ib anteriorment present). 2006 a 2011 A la població, dominava el genotip 21 (segons SSR), la proporció del qual va arribar al 90%, després del qual la palma va passar al genotip 20, la freqüència d’aparició dels quals en els propers dos anys es va mantenir al voltant del 67% (Acuña, 2015).
Europa
A la història d’Europa, hi ha hagut almenys dues onades migratòries de P. infestans des d’Amèrica del Nord: al segle XIX. (HERB-1) i principis del segle XX (EUA-1). La distribució omnipresent de fungicides que contenen metalaxil als anys 70. va provocar el desplaçament del genotip dominant US-1 i la seva substitució per nous genotips. Com a resultat, a la majoria de països d’Europa occidental, les poblacions del patogen estaven representades principalment per diverses línies clonals.
L’ús de l’anàlisi de microsatèl·lits per a l’anàlisi de les poblacions de patògens va permetre identificar canvis greus que es van produir a Europa occidental el 2005-2008. El 2005 es va descobrir una nova línia clonal al Regne Unit, anomenada 13_A2 (o “Blue 13”) i caracteritzada pel tipus d’aparellament A2. , alta agressivitat i resistència a les fenilamides (Shaw et al., 2007). El mateix genotip es va trobar en mostres recollides el 2004 als Països Baixos i al nord de França, cosa que suggereix que va migrar al Regne Unit des de l’Europa continental, possiblement amb patates de llavor (Cooke et al., 2007). L’estudi del genoma dels representants d’aquesta línia clonal va mostrar un alt grau de polimorfisme de la seva seqüència (el 2016, el nombre de les seves variacions subclonals va arribar a 340) i un grau significatiu de variació en el nivell d’expressió gènica, incl. gens efectors durant la infecció de les plantes (Cooke et al., 2012; Cooke, 2017). Aquestes característiques, juntament amb l’augment de la durada de la fase biotròfica, podrien causar una major agressivitat de 13_A2 i la seva capacitat per infectar fins i tot varietats de patata resistents al tizó tardà.
En els propers anys, el genotip es va estendre ràpidament pels països del nord-oest d’Europa (Gran Bretanya, Irlanda, França, Bèlgica, els Països Baixos, Alemanya) amb el desplaçament simultani dels genotips 1_A1, 2_A1, 8_A1 anteriorment dominants (Montarry et al., 2010; Gisi et al. , 2011; Van den Bosch et al., 2011; Cooke, 2015; Cooke, 2017). Segons el lloc web www.euroblight.net, la proporció de 13_A2 en les poblacions d'aquests països va arribar al 60-80% i més; la presència d’aquest genotip també s’ha registrat en alguns països de l’Est i el Sud d’Europa. Tanmateix, el 2009-2012. 13_A2 va perdre les seves posicions dominants a Gran Bretanya i França, cedint a la línia 6_A1 (8_A1 a Irlanda), i als Països Baixos i Bèlgica va ser parcialment substituït pels genotips 1_A1, 6_A1 i 33_A2 (Cooke et al., 2012; Cooke, 2017; Stellingwerf, 2017).
Fins ara, aproximadament el 70% de la població d’Europa occidental de P. infestans és monoclonal. Segons el lloc web www.euroblight.net, els genotips dominants als països del nord-oest d’Europa (Regne Unit, França,
Països Baixos, Bèlgica) es mantenen, aproximadament en proporcions iguals, 13_A2 i 6_A1, aquest últim pràcticament no es troba fora de la regió especificada (a excepció d'Irlanda), però ja té almenys 58 subclons (Cooke, 2017). Les variacions 13_A2 són presents en un nombre notable a Alemanya, i també s’observen esporàdicament als països d’Europa central i meridional. El genotip 1_A1 constitueix una part important de les poblacions de Bèlgica i en part dels Països Baixos i França. El genotip 8_A1 s’ha estabilitzat a la població europea al nivell del 3-6%, a excepció d’Irlanda, on manté la seva posició de lideratge i es divideix en dos subclons (Stellingwerf, 2017). Finalment, el 2016 es va observar un augment de la freqüència d’aparició de nous genotips 36_A2 i 37_A2, registrats per primera vegada el 2013-2014; fins ara, aquests genotips es troben als Països Baixos i Bèlgica i en part a França i Alemanya, així com a la part sud de Gran Bretanya (Cooke, 2017). Aproximadament el 20-30% de la població d’Europa occidental està representada per genotips únics cada any.
A diferència de l’Europa occidental, quan va aparèixer el genotip 13_A2, les poblacions del nord d’Europa (Suècia, Noruega, Dinamarca, Finlàndia) estaven representades no per línies clonals, sinó per un gran nombre de genotips únics (Brurberg et al.,
2011). Durant el període de propagació activa de 13_A2 a Europa Occidental, la presència d’aquest genotip a Escandinàvia no es va notar fins al 2011, quan es va descobrir per primera vegada al nord de Jutlàndia (Dinamarca), on es cultiven principalment varietats industrials de patata amb l’ús actiu de metalaxil. fungicides (Nielsen et al., 2014). Segons www.euroblight.net, el genotip 13_A2 també es va detectar en diverses mostres de Noruega i Dinamarca el 2014 i en diverses mostres noruegues el 2016; a més, el 2013 es va constatar la presència del genotip 6_A1 en una petita quantitat a Finlàndia. Es considera que la principal raó del fracàs de 13_A2 i altres línies clonals en la conquesta d'Escandinàvia són les diferències climàtiques d'aquesta regió respecte als països d'Europa occidental.
A més del fet que els estius frescos i els hiverns freds contribueixen a la supervivència de les oospores en lloc del miceli vegetatiu (Sjöholm et al., 2013), la congelació del sòl a l’hivern (que normalment no es produeix als països més càlids d’Europa occidental) contribueix a la sincronització de la germinació i la plantació de les oospores. patates, cosa que millora el seu paper com a font d’infecció primària (Brurberg et al., 2011). També cal assenyalar que, en condicions del nord, el desenvolupament de la infecció a partir d’ospores supera el desenvolupament de la infecció tuberosa, que en última instància impedeix el domini de línies clonals encara més agressives, però més tard desenvolupades (Yuen, 2012). L’estructura de les poblacions de P. infestans més estudiades als països d’Europa de l’Est (Polònia, estats bàltics) és molt similar a la d’Escandinàvia.
Els dos tipus d’aparellament també hi són presents, i la gran majoria de genotips determinats per l’anàlisi SSR són únics (Chmielarz et al., 2014; Runno-Paurson et al., 2016). Com al nord d’Europa, la distribució de línies clonals (principalment del genotip 13_A2) pràcticament no va afectar les poblacions locals del patogen, que conserven un alt nivell de diversitat amb l’absència de línies dominants pronunciades.
La presència de 13_A2 s’observa ocasionalment en camps amb varietats comercials de patata. A Rússia, la situació es desenvolupa de manera similar. Anàlisi de microsatèl·lits d’aïllats de P. infestans recollits el 2008-2011 a 10 regions diferents de la part europea de Rússia, van mostrar un alt grau de diversitat genotípica i una manca total de coincidències amb les línies clonals europees (Statsyuk et al., 2014). Diversos anys després, un estudi de mostres de P. infestans recollides a la regió de Leningrad el 2013-2014 va mostrar diferències significatives entre ells i els genotips d'aquesta regió identificats en l'estudi anterior. En ambdós estudis no es van trobar genotips d’Europa occidental (Beketova et al., 2014; Kuznetsova et al., 2016).
L’alta diversitat genètica de les poblacions de P. infestans a l’Europa de l’Est i l’absència de línies clonals dominants en elles pot estar relacionada amb diversos motius. En primer lloc, com al nord d’Europa, les condicions climàtiques dels països considerats contribueixen a la formació d’ospores com a font principal d’infecció (Ulanova et al., 2010; Chmielarz et al., 2014). En segon lloc, una proporció significativa de patates produïdes en aquests països es cultiven en petites finques privades, sovint envoltades de boscos o altres obstacles per al lliure moviment de material infecciós (Chmielarz et al., 2014). Com a regla general, les patates cultivades en aquestes condicions pràcticament no es tracten amb productes químics i l’elecció de les varietats es basa en la seva resistència tardana a la tizones, és a dir, no hi ha pressió selectiva per a l’agressivitat i resistència al metalaxil, que priva avantatges dels genotips resistents, com el 13_A2, respecte d’altres genotips (Chmielarz et al., 2014). Finalment, a causa de la petita mida de les parcel·les, els seus propietaris no solen practicar la rotació de cultius, cultivant patates durant anys al mateix lloc, cosa que contribueix a l’acumulació d’un inòcul genèticament divers (Runno-Paurson et al., 2016; Elansky, 2015; Elansky et al. ., 2015).
Àsia
Fins fa poc, l’estructura de les poblacions de P. infestans a Àsia es mantenia relativament poc coneguda. Se sabia que es representa principalment per línies clonals i que l’efecte de la recombinació sexual sobre l’aparició de nous genotips és molt petit. Així, per exemple, el 1997-1998. A la part asiàtica de Rússia (Sibèria i Extrem Orient), la població patògena només estava representada per tres genotips amb predomini del genotip SIB-1 (Elansky et al., 2001). La presència de línies patògenes clonals s’ha demostrat a països com la Xina, el Japó, Corea, Filipines i Taiwan (Koh et al., 1994; Chen et al., 2009). La línia clonal US-1 va dominar un gran territori asiàtic a finals dels anys 90 - principis dels 2000. gairebé a tot arreu es va començar a substituir per altres genotips, que, al seu torn, van donar pas a altres de nous. En la majoria dels casos, els canvis en l'estructura i composició de les poblacions dels països asiàtics es van associar a la migració de nous genotips des de fora. Per tant, al Japó, a excepció del genotip JP-3, tots els altres genotips japonesos que van aparèixer després dels EUA-1 (JP-1, JP-2, JP-3) tenen un origen extern més o menys demostrat (Akino et al., 2011) ... Actualment, hi ha tres poblacions principals de patògens a la Xina, amb una clara divisió geogràfica; No hi ha cap flux genètic o molt dèbil entre aquestes poblacions (Guo et al., 2010; Li et al., 2013b). El genotip 13_A2 va aparèixer al territori de la Xina a les seves províncies del sud (Yunnan i Sichuan) el 2005-2007 i el 2012-1014. també es va veure al nord-est del país (Li et al., 2013b). A l’Índia, 13_A2 apareixia presumiblement al mateix temps que a la Xina, molt probablement amb patates de llavor infectades (Chowdappa et al., 2015) i el 2009-2010. va provocar una greu epifitosi del tizó tardà al tomàquet al sud del país, després de la qual es va estendre a les patates i el 2014 va provocar un brot de tos tardana a Bengala Occidental, que va provocar la ruïna i el suïcidi de molts agricultors locals (Fry, 2016).
Àfrica
Fins al 2008-2010 no s’han dut a terme estudis sistemàtics de P. infestans als països africans. De moment, les poblacions africanes de P. infestans es poden dividir en dos grups, i aquesta divisió està clarament associada al fet d’importar patates de llavor d’Europa.
Al nord d’Àfrica, que importa activament patates de llavor d’Europa, el tipus d’aparellament A2 està àmpliament representat a gairebé totes les regions, cosa que proporciona una possibilitat teòrica de l’aparició de nous genotips com a resultat de la recombinació sexual (Corbière et al., 2010; Rekad et al., 2017). A més, a Algèria, s’observa la presència dels genotips 13_A2, 2_A1 i 23_A1 amb una pronunciada dominació del primer d’ells, així com una disminució gradual de la proporció de genotips únics fins a la seva completa desaparició (Rekad et al., 2017). A diferència de la resta de la regió, a Tunísia (a excepció del nord-est del país), la població patògena està representada principalment pel tipus d'aparellament A1 (Harbaoui et al., 2014).
La línia clonal NA-01 és dominant aquí. En general, la proporció de línies clonals a la població és només del 43%. A l’Àfrica oriental i meridional, on els volums d’importacions de llavors són molt reduïts (Fry et al., 2009), P. infestans només està representada per dues línies clonals de tipus A1, US-1 i KE-1, i la segona desplaça activament la primera per les patates ( Pule et al., 2012; Njoroge et al., 2016). Fins ara, aquests dos genotips tenen un nombre notable de variacions subclonals.
Austràlia
El primer informe sobre la pataca tardana a les patates a Austràlia es remunta al 1907 i la primera epifitòtia, presumiblement causada per les fortes pluges dels mesos d’estiu, es va produir el 1909-1911. (Drenth et al., 2002). No obstant això, en general, el tizón tardà no té cap importància econòmica significativa per al país. Els brots esporàdics de tizones tardanes, provocats per les condicions meteorològiques que proporcionen una elevada humitat, no es produeixen més d'una vegada cada 5-7 anys i es localitzen principalment al nord de Tasmània i al centre de Victoria. En relació amb l’anterior, les publicacions dedicades a l’estudi de l’estructura de la població australiana de P. infestans són pràcticament absents. La informació més recent disponible és del 1998 al 2000. (Drenth et al., 2002). Segons els autors, la població de Victoria era una línia clonal US-1.3, que indirectament va confirmar la migració d’aquest genotip des dels Estats Units. Els exemplars de Tasmània es van classificar com AU-3, diferents dels genotips que hi havia presents en aquella època a altres parts del món.
Característiques del desenvolupament de la malaltia tardana a Rússia
A Europa, la infecció es va introduir amb tubercles de llavors malalts, oospores que hivernaven al sòl, així com zoosporangia provocada pel vent de plantes cultivades a partir de tubercles hivernats als camps de l'any passat (plantes "voluntàries"), o en munts de massacres marcador per a l'emmagatzematge de tubercles. D’aquestes, les plantes cultivades en munts de tubercles rebutjats es consideren la font d’infecció més perillosa. allà, el nombre de tubercles germinats és sovint significatiu i es pot transportar zoosporangia a distància llarga. La resta de fonts (oospores, plantes "voluntàries") no són tan perilloses, ja que no és habitual cultivar plantes en els mateixos camps més d'una vegada cada 3-4 anys. La infecció per tubercles de llavors malaltes també és mínima a causa d’un bon sistema de control de qualitat de les llavors.
En general, la quantitat d’inòcul a les poblacions europees és limitada i, per tant, l’augment de l’epidèmia és bastant lent i es pot controlar amb èxit mitjançant preparacions fungicides químiques. La tasca principal en les condicions europees és la lluita contra les infeccions en la fase en què comença la dispersió massiva de zoosporangia de les plantes afectades.
A Rússia, la situació és radicalment diferent. La major part del cultiu de patates i tomàquets es cultiva en petits jardins privats; o bé no s’hi prenen mesures de protecció, o bé es realitzen tractaments fungicides en un nombre insuficient i comencen després de l’aparició d’un tizó tardà a la part superior. Com a resultat, els horts privats actuen com la principal font d’infecció, des d’on el vent porta la zoosporangia a les plantacions comercials. Ho confirmen les nostres observacions directes a les regions de Moscou, Bryansk, Kostroma i Riazan: s’observen danys a les plantes dels jardins privats fins i tot abans d’iniciar els tractaments fungicides de les plantacions comercials. Posteriorment, l'epidèmia en grans camps es veu limitada per l'ús de preparats fungicides, mentre que als jardins privats es produeix un ràpid desenvolupament del tizó tardà.
En el cas de tractaments inadequats o "pressupostaris" de les plantacions comercials, també apareixen focus de tardo tardà als camps; posteriorment, es desenvolupen activament i cobreixen àrees cada vegada més grans (Elansky, 2015). La infecció en jardins privats té un impacte significatiu en les epidèmies en camps comercials. A totes les regions productores de patates de Rússia, la superfície ocupada per les patates als jardins privats és diverses vegades superior a la superfície total de camps de grans productors. En aquest entorn, els horts privats es poden veure com un recurs d’inòcul global per a camps comercials. Intentem identificar aquelles propietats que són característiques dels genotips de soques dels jardins privats.
La plantació de control de llavors i de quarantena de patates de consum, llavors de tomàquet obtingudes de dubtosos productors estrangers, cultiu a llarg termini de patates i tomàquets a les mateixes zones, tractaments fungicides inadequats o la seva absència completa comporten greus epifitòtics al sector privat, el resultat dels quals és gratuït encreuament, hibridació i formació d’ospores en jardins privats. Com a resultat, s’observa una diversitat genotípica molt alta del patogen, quan gairebé totes les soques són úniques en el seu genotip (Elansky et al., 2001, 2015). La plantació de patates de llavors de diversos orígens genètics fa que sigui improbable que apareguin línies clonals especialitzades a atacar una determinada varietat. Les soques seleccionades en aquest cas es distingeixen per la seva versatilitat en relació amb les varietats afectades, la majoria d’elles tenen un nombre proper al màxim de gens de virulència. Això és molt diferent del sistema de "línies clonals" típic per a grans camps d'empreses agrícoles amb un sistema de protecció adequadament instal·lat contra el tizó tardà. Les "línies clonals" (quan totes les soques del patogen del tizó tardà al camp estan representades per un o més genotips) són omnipresents en països on el cultiu de la patata es duu a terme exclusivament per grans explotacions: EUA, Països Baixos, Dinamarca, etc. creixent la patata, també hi ha una diversitat genotípica més alta als jardins privats. A finals del segle XX, les “línies clonals” estaven àmpliament esteses a les parts asiàtiques i de l’extrem orient de Rússia (Elansky et al., 20), cosa que aparentment es deu a l’ús de les mateixes varietats de patates exclusivament per plantar. Recentment, la situació en aquestes regions també va començar a canviar cap a un augment de la diversitat genotípica de les poblacions.
La manca de tractaments intensius amb preparats fungicides té una altra conseqüència directa: no hi ha acumulació de soques resistents als jardins. De fet, els nostres resultats mostren que les soques resistents al metalaxil es troben significativament amb menys freqüència als jardins privats que a les plantacions comercials.
L’estreta proximitat de les plantacions de patates i tomàquets, típics dels jardins privats, facilita la migració de soques entre aquests cultius, com a resultat de la qual, en la darrera dècada, entre les soques aïllades de les patates, la proporció de soques que porten el gen de resistència a les varietats de tomàquet cherry (T1), abans característica només de ceps de tomàquet. Les soques amb el gen T1 en la majoria dels casos són molt agressives tant per a les patates com per als tomàquets.
En els darrers anys, la plaga tardana del tomàquet va començar a aparèixer en molts casos abans que en les patates. Les plàntules de tomàquet poden ser infestades per oospores al sòl o oospores presents a les llavors de tomàquet o adherides a elles (Rubin et al., 2001). En els darrers 15 anys, un gran nombre de llavors empaquetades econòmiques, principalment importades, han aparegut a les botigues i la majoria dels petits productors han canviat a utilitzar-les. Les llavors poden aportar soques amb genotips típics de les regions del seu cultiu. En el futur, aquests genotips s’inclouran en el procés sexual dels jardins privats, cosa que conduirà a l’aparició de genotips completament nous.
D'aquesta manera, es pot afirmar que els horts privats són un "brollador" mundial, en el qual, com a resultat de l'intercanvi de material genètic, es processen els genotips existents i apareixen de nous. A més, la seva selecció es realitza en condicions molt diferents de les creades per a les patates a les grans explotacions: absència de premsa fungicida, uniformitat varietal de les plantacions, predomini de les plantes afectades per diverses formes d’infecció vírica i bacteriana, proximitat a tomàquets i solanites silvestres, creuament actiu i formació d’ospores, possibilitat perquè les oospores actuïn com a font d’infecció durant el proper any.
Tot plegat condueix a una diversitat genotípica molt elevada de poblacions de jardins. En condicions epifitòtiques, el tizó tardà s’estén molt ràpidament als horts i s’alliberen grans quantitats d’espores, que volen a les plantacions comercials properes. No obstant això, havent entrat als camps comercials amb el sistema correcte de tecnologia agrícola i protecció química, les espores que han arribat pràcticament no tenen cap oportunitat d’iniciar epifitòtics al camp, cosa que es deu a l’absència de línies clonals resistents als fungicides i especialitzades en la varietat cultivada.
Una altra font d’inòcul primari poden ser els tubercles malalts atrapats en plàntules comercials. Aquests tubercles es conreaven, per regla general, en camps amb bona tecnologia agrícola i protecció química intensiva. Els genotips dels aïllats que afectaven els tubercles s’adapten al desenvolupament de la seva pròpia varietat. Aquestes soques són significativament més perilloses per a la plantació comercial que els inòculs originats en jardins privats. Els resultats de la nostra investigació també avalen aquesta suposició. Les poblacions aïllades de grans camps amb una protecció química adequada i una bona tecnologia agrícola no difereixen en l’alta diversitat genotípica. Sovint es tracta de diverses línies clonals que són molt agressives.
Les soques de material comercial de llavors poden entrar a les poblacions d’horts i participar en els processos que s’hi desenvolupen. Tanmateix, en un hort, la seva competitivitat serà molt inferior a la d’un camp comercial i aviat deixaran d’existir en forma de línia clonal, però els seus gens es poden utilitzar a la població de “jardins”.
La infecció que es desenvolupa en plantes "voluntàries" i en munts de tubercles sacrificats durant la collita no és tan rellevant per a Rússia, perquè A les principals regions productores de patates de Rússia, s’observa una congelació profunda del sòl hivernal i poques vegades es desenvolupen plantes de tubercles que han hivernat al sòl. A més, tal com demostren els nostres experiments, el patogen de la plaga tardana no sobreviu a temperatures negatives, fins i tot en tubercles que han conservat la seva viabilitat. A la zona àrida, on es practica el cultiu de patates primerenques, el tizó tardà és bastant rar a causa de la temporada de creixement seca i calorosa.
Per tant, actualment observem la divisió de les poblacions de P. infestans en poblacions de "camp" i "jardí". No obstant això, en els darrers anys s’han observat processos que condueixen a la convergència i interpenetració de genotips d’aquestes poblacions.
Entre ells, es pot observar un augment generalitzat de l’alfabetització dels petits productors, l’aparició de petits paquets assequibles de llavors de patata, la propagació de preparats fungicides en petits paquets i la pèrdua de la por a la "química" per part de la població.
Es produeixen situacions quan, gràcies a la vigorosa activitat d’un proveïdor, es planten pobles sencers amb tubercles de llavors de la mateixa varietat i s’ofereixen petits paquets dels mateixos pesticides. Es pot suposar que les patates de la mateixa varietat es trobaran a les plantacions comercials properes.
D'altra banda, algunes empreses comercialitzadores de pesticides estan promovent esquemes de tractament químic "pressupostaris". En aquest cas, es subestima el nombre de tractaments recomanats i s’ofereixen fungicides més econòmics, i no es posa èmfasi en evitar el desenvolupament de tizones fins a la sega de les tapes, sinó en un cert retard en l’epifitotip per tal d’augmentar el rendiment. Aquests esquemes es justifiquen econòmicament quan es cultiven patates de consum a partir de material de llavors de baixa qualitat, quan en principi no es tracta d’obtenir un alt rendiment. No obstant això, en aquest cas, a diferència de les poblacions de jardins, el fons genètic anivellat de la patata contribueix a la selecció de races fisiològiques específiques, molt perilloses per a aquesta varietat.
En general, les tendències cap a la convergència de mètodes de "jardí" i "de camp" de producció de patates ens semblen força perilloses. Per evitar les seves conseqüències negatives, tant al sector domèstic com comercial, caldrà controlar tant l’assortiment de patates de llavor com la gamma de fungicides que s’ofereix als propietaris privats en petits envasos, així com el seguiment dels esquemes de protecció de la patata i l’ús de preparats fungicides al sector comercial.
A les àrees del sector privat, hi ha un intens desenvolupament no només de la malaltia tardana, sinó també d’Alternaria. La majoria dels propietaris de finques privades no prenen mesures especials per protegir-se contra Alternaria, confonent el desenvolupament d'Alternaria amb el marciment natural del fullatge o el desenvolupament del tizó tardà. Per tant, amb el desenvolupament massiu d’Alternaria en varietats susceptibles, les parcel·les domèstiques poden servir com a font d’inòcul per a plantacions comercials.
Mecanismes de variabilitat
Procés de mutació
Atès que l’aparició de mutacions és un procés aleatori que procedeix amb una freqüència baixa, l’aparició de mutacions en qualsevol locus depèn de la freqüència de mutació d’aquest locus i de la mida de la població. En estudiar la freqüència de mutacions de les soques de P. infestans, se sol determinar el nombre de colònies cultivades en suports selectius de nutrients després del tractament amb mutàgens químics o físics. Com es pot veure a partir de les dades presentades a la taula 8, la freqüència de mutació de la mateixa soca en diferents locus pot diferir per diversos ordres de magnitud. L'alta freqüència de mutacions en la resistència al metalaxil pot ser una de les raons de l'acumulació de soques resistents a la natura.
La freqüència de mutacions espontànies o induïdes, calculada sobre la base d’experiments de laboratori, no sempre correspon als processos que es produeixen en poblacions naturals, per les següents raons:
1. Amb les fissions nuclears asíncrones, és impossible estimar la freqüència de mutacions per generació nuclear. Per tant, la majoria dels experiments proporcionen informació només directament sobre la freqüència de les mutacions, sense distingir entre dos esdeveniments mutacionals i un esdeveniment després de la mitosi.
2. Les mutacions d’un sol pas solen reduir l’equilibri del genoma, per tant, juntament amb l’adquisició d’una nova propietat, disminueix la forma general de l’organisme. La majoria de les mutacions obtingudes experimentalment tenen una agressivitat reduïda i no es registren en poblacions naturals. Així, el coeficient de correlació entre el grau de resistència dels mutants de P. infestans als fungicides fenilamidics i la taxa de creixement en un entorn artificial va ser de mitjana (-0,62), i la resistència als fungicides i l’agressivitat de les fulles de la patata (-0,65) (Derevyagina et al. , 1993), que indica la baixa aptitud dels mutants. Les mutacions de resistència al dimetomorf també van anar acompanyades d’una forta disminució de la viabilitat (Bagirova et al., 2001).
3. La majoria de mutacions espontànies i induïdes són recessives i no es manifesten fenotípicament en experiments, sinó que constitueixen una reserva oculta de variabilitat en poblacions naturals. Les soques mutants aïllades en experiments de laboratori porten mutacions dominants o semi-dominants (Kulish i Dyakov, 1979). Aparentment, la diploïdia nuclear explica els intents fallits d’obtenir mutants sota la influència de la irradiació UV que són virulents en varietats anteriorment resistents (McKee, 1969). Segons els càlculs de l'autor, aquestes mutacions es poden produir amb una freqüència inferior a 1: 500000. La transició de mutacions recessives a un estat homozigòtic, expressat fenotípicament, es pot produir a causa de la recombinació sexual o asexual (vegeu més avall). Tanmateix, fins i tot en aquest cas, la mutació pot ser emmascarada pels al·lels dominants dels nuclis de tipus salvatge al miceli cenòtic (multinucleat) i fixada fenotípicament només durant la formació de zoospores mononuclears.
Taula 8. Freqüència de mutacions de P. infestans a substàncies inhibidores del creixement sota l’acció de la nitrosometilurea (Dolgova, Dyakov, 1986; Bagirova et al., 2001)
Connexió | Freqüència de mutació |
Oxitetraciclina | 6,9 10 x-8 |
Blasticidina S | 7,2 10 x-8 |
Estreptomicina | 8,3 x10-8 |
Tricotecina | 1,8 10 x-8 |
Cicloheximida | 2,1 10 x-8 |
Daaconil | <4 x 10-8 |
Dimethomorph | 6,3 10 x-7 |
Metalaxil | 6,9 10 x-6 |
La mida de la població també juga un paper decisiu en l’aparició de mutacions espontànies. En poblacions molt grans, en què el nombre de cèl·lules N> 1 / a, on a és la taxa de mutació, la mutació deixa de ser un fenomen aleatori (Kvitko, 1974).
Els càlculs mostren que amb una infestació mitjana d’un camp de patates (35 taques per planta), es formen diàriament 8x1012 espores en una hectàrea (Dyakov i Suprun, 1984). Aparentment, aquestes poblacions contenen totes les mutacions permeses pel tipus d’intercanvi a cada locus. Fins i tot una rara mutació, que es produeix amb una freqüència de 10 a 9, serà adquirida per mil individus de milions que viuen en una hectàrea d’un camp de patates. Per a les mutacions que es produeixen amb una freqüència més elevada (per exemple, 10-6), en aquesta població, es poden produir diverses mutacions diàries diàriament (simultàniament en dos loci), és a dir, el procés de mutació substituirà la recombinació.
Migracions
Per a P. infestans, es coneixen dos tipus principals de migració: tancar distàncies (dins d’un camp de patates o camps veïns) estenent zoosporangia per corrents d’aire o esprai de pluja i a distàncies llargues, amb plantació de tubercles o fruits de tomàquet transportats. El primer mètode preveu l'expansió del focus de la malaltia, el segon: la creació de nous focus en llocs allunyats de la primària.
La propagació de la infecció per tubercles i fruites de tomàquet no només contribueix a l’aparició de la malaltia en nous llocs, sinó que també és la principal font de diversitat genètica de les poblacions. A la regió de Moscou, es conreen patates, procedents de diferents regions de Rússia i Europa occidental. Els fruits del tomàquet es porten de les regions del sud de Rússia (regió d’Astrakhan, territori de Krasnodar, nord del Caucas). Les llavors de tomàquet, que també poden servir com a fonts d’infecció (Rubin et al., 2001), també s’importen de les regions del sud de Rússia, Xina, països europeus i altres països.
Segons càlculs d ’E. Mayr (1974), els canvis genètics en una població local causats per mutacions poques vegades superen els 10-5 per locus, mentre que en les poblacions obertes, l’intercanvi a causa del contracorrent de gens és com a mínim de 10-3 - 10-4.
La migració de tubercles infectats és responsable de l'entrada de P. infestans a Europa, que s'estén a totes les regions del món on es conreen patates; van provocar els canvis de població més greus. La plaga tardana de les patates va aparèixer al territori de l'Imperi rus gairebé simultàniament a la seva aparició a l'Europa occidental.
Atès que la malaltia es va observar per primera vegada el 1846-1847 als països bàltics i només en els anys posteriors es va estendre a Bielorússia i les regions nord-occidentals de Rússia, el seu origen a Europa occidental és evident. La primera font de tímida tardana al Vell Món no és tan evident. La hipòtesi desenvolupada per Fry et al. (Fry et al., 1992; Fry, Goodwin, 1995; Goodwin et al., 1994) suggereix que el paràsit primer va venir de Mèxic a Amèrica del Nord, on es va estendre pels cultius i després va ser transportat a Europa occidental. (fig. 7).
Com a conseqüència de la deriva repetida (doble efecte del "coll d'ampolla"), els clons individuals van arribar a Europa, la descendència de la qual va provocar una pandèmia a tot el territori del Vell Món, on es cultiven les patates. Com a prova d’aquesta hipòtesi, els autors citen, en primer lloc, l’ocurrència omnipresent d’un sol tipus d’aparellament (A1) i, en segon lloc, l’homogeneïtat dels genotips de les soques estudiades de diferents regions (tots ells es basen en marcadors moleculars, inclosos dos locus d’isozima, patrons d’empremtes digitals d’ADN i l'estructura de l'ADN mitocondrial és idèntica i correspon al clon US-2 descrit als EUA). No obstant això, algunes dades generen dubtes sobre almenys algunes de les disposicions de la hipòtesi exposada. L'anàlisi de l'ADN mitocondrial de P. infestans aïllat de mostres de patata herbari infectades durant el primer període epifitòtic de la dècada de 1 va mostrar que difereixen en l'estructura de l'ADN mitocondrial del clon US-40, que, per tant, era almenys no és l’única font d’infecció a Europa (Ristaino et al, 1).
La situació de la malaltia tardana va empitjorar de nou als anys 80 del segle XX. S'han produït els canvis següents:
1) L’agressivitat mitjana de la població ha augmentat, cosa que ha conduït, en particular, a l’extensió generalitzada de la forma més nociva de tizones tardanes: danys als pecíols i tiges.
2) Es va produir un canvi en el moment de la tardor de les patates: des de finals de juliol fins a principis de juliol i fins i tot fins a finals de juny.
3) El tipus d'aparellament A2, que anteriorment estava absent al Vell Món, s'ha convertit en omnipresent.
Els canvis van anar precedits de dos esdeveniments: l’ús massiu del nou fungicida metalaxil (Schwinn i Staub, 1980) i l’aparició de Mèxic com a exportador mundial de patates (Niederhauser, 1993). D'acord amb això, es van presentar dues raons per als canvis de la població: la conversió del tipus d'aparellament sota la influència del metalaxil (Ko, 1994) i la introducció massiva de noves soques amb tubercles infectats de Mèxic (Fry i Goodwin, 1995). Tot i que interconversions de tipus d'aparellament sota la influència del metalaxil no només les va obtenir Ko, sinó també en treballs realitzats al laboratori de la Universitat Estatal de Moscou (Savenkova, Chherepennicova-Anikina, 2002), és preferible la segona hipòtesi. Juntament amb l'aparició del segon tipus d'aparellament, es van produir greus canvis en els genotips de soques russes de P. infestans, inclosos els gens neutres (isozim i loci RFLP), així com en l'estructura de l'ADN mitocondrial. El complex d’aquests canvis no es pot explicar per l’acció del metalaxil; més aviat hi va haver una importació massiva de noves soques de Mèxic, que, en ser més agressives (Kato et al., 1997), van desplaçar les soques velles (EUA-1), convertint-se en dominants de les poblacions. El canvi en la composició de les poblacions europees es va produir en molt poc temps (de 1980 a 1985) (Fry et al., 1992). Al territori de l'antiga URSS, es van trobar "noves soques" a les col·leccions d'Estònia el 1985, és a dir, abans que a Polònia i Alemanya (Goodwin et al., 1994). La darrera vegada que es va aïllar la "vella soca US-1" a Rússia d'un tomàquet infectat a la regió de Moscou el 1993 (Dolgova et al., 1997). També a França, es van trobar soques “velles” a les plantacions de tomàquet fins a principis dels 90, és a dir, després que desapareguessin des de feia molt de temps a les patates (Leberton i Andrivon, 1998). Els canvis en les soques de P. infestans van afectar molts trets, inclosos els de gran importància pràctica, i van augmentar la nocivitat del tizó tardà.
Recombinació sexual
Per tal que la recombinació sexual contribueixi a la variabilitat, és necessari, en primer lloc, la presència de dos tipus d’aparellament a la població en una proporció propera a l’1: 1 i, en segon lloc, la presència de la variabilitat inicial de la població.
La proporció de tipus d'aparellament varia molt en diferents poblacions i fins i tot en anys diferents en una població (taules 9,10, 90). Es desconeixen les raons d’aquests canvis dràstics en les freqüències dels tipus d’aparellament en les poblacions (com, per exemple, a Rússia o a Israel a principis dels 2002 del segle passat), però es creu que això es deu a la introducció de clons més competitius (Cohen, XNUMX).
Algunes dades indirectes indiquen el curs del procés sexual en determinats anys i en determinades regions:
1) Els estudis de poblacions de la regió de Moscou van mostrar que en 13 poblacions en què la proporció del tipus d’aparellament A2 era inferior al 10%, la diversitat genètica total calculada per a tres loci d’isozima era de 0,08 i en 14 poblacions en què la proporció d’A2 superava El 30%, la diversitat genètica era el doble (0,15) (Elansky et al., 1999). Així, com més gran sigui la probabilitat de tenir relacions sexuals, major serà la diversitat genètica de la població.
2) La relació entre la proporció de tipus d'aparellament en poblacions i la intensitat de la formació d'ospores es va observar a Israel (Cohen et al., 1997) i a Holanda.
(Flier et al., 2004). Els nostres estudis han demostrat que, en poblacions en què els aïllats amb el tipus d’aparellament A2 representaven el 62, el 17, el 9 i el 6%, es van trobar oospores al 78, 50, 30 i 15% de les fulles de patata analitzades (amb 2 o més taques), respectivament.
Les mostres amb 2 o més taques eren molt més propenses a contenir oospores que les mostres amb 1 taca (32 i 14% de les mostres, respectivament) (Apryshko et al., 2004).
Les espòsores eren molt més freqüents a les fulles de la capa mitjana i inferior de la planta de la patata (Mytsa et al., 2015; Elansky et al., 2016).
3) En algunes regions, s’han descobert genotips únics, l’aparició dels quals s’associa amb la recombinació sexual. Així, a Polònia el 1989 i a França el 1990, les soques homozigotes de la glucosa-6-
fosfat isomerasa (GPI 90/90). Com que anteriorment només es van trobar 10/90 heterozigots durant 100 anys, l'homozigositat s'atribueix a la recombinació sexual (Sujkowski et al., 1994). A Colòmbia (EUA), els aïllats que combinen A2 amb GPI 100/110 i A1 amb GPI 100/100 són habituals, però, al final de la temporada 1994 (16 d’agost i 9 de setembre), les soques amb genotips recombinants (A1 GPI 100/110 i A2 GPI 100/100) (Miller et al., 1997).
4) En algunes poblacions de Polònia (Sujkowski et al., 1994) i del nord del Caucas (Amatkhanova et al., 2004), la distribució de loci d’ADN d’empremtes digitals i locus de proteïnes al·locimals correspon a la distribució de Hardy-Weinberg, que indica
sobre l’alta proporció de la contribució de la recombinació sexual a la variabilitat de les poblacions. En altres regions de Rússia, no es va trobar cap correspondència amb la distribució de Hardy-Weinberg en les poblacions, però es va mostrar la presència de desequilibri del lligam, cosa que indica el predomini de la reproducció clonal (Elansky et al., 1999).
5) La diversitat genètica (GST) entre soques amb diferents tipus d'aparellament (A1 i A2) va ser menor que entre diferents poblacions (Sujkowski et al., 1994), la qual cosa indica indirectament creus sexuals.
Al mateix temps, la contribució de la recombinació sexual a la diversitat de la població no pot ser molt elevada. Aquesta contribució es va calcular per a les poblacions de la regió de Moscou (Elansky et al., 1999). Segons els càlculs de Lewontin (1979) "la recombinació, que pot produir noves variants a partir de dos locis amb una freqüència que no excedeix el producte de les seves heterozigositats, només es fa efectiva si els valors de l'heterozigositat per als dos al·lels ja són elevats".
Amb la proporció dels dos tipus d’aparellament, típica de la regió de Moscou, igual a 4: 1, la freqüència de recombinació serà de 0,25. La probabilitat que les soques creuades siguin heterozigotes per a dos dels tres locis isozigots estudiats en les poblacions estudiades va ser de 0,01 (2 soques de 177). En conseqüència, la probabilitat d’aparició d’heterozigots dobles com a resultat de la recombinació no hauria de superar el seu producte multiplicat per la probabilitat d’encreuament (0,25x0,02x0,02) = 10-4, és a dir, els recombinants sexuals no solen caure en la mostra estudiada de soques. Aquests càlculs es van fer per a les poblacions de la regió de Moscou, que es caracteritzen per una variabilitat relativament alta. En les poblacions monomòrfiques com les siberianes, el procés sexual, fins i tot si es produeix en poblacions individuals, no pot influir en la seva diversitat genètica.
A més, P. infestans es caracteritza per una desalineació freqüent dels cromosomes a la meiosi, que condueix a l’aneuploïdia (Carter et al., 1999). Aquestes infraccions redueixen la fertilitat dels híbrids.
Recombinació parasexual, conversió de gens mitòtics
En experiments sobre l’empalmament de soques de P. infestans amb mutacions de resistència a diferents inhibidors del creixement, es va trobar l’aparició de misolats resistents als dos inhibidors (Shattock i Shaw, 1975; Dyakov, Kuzovnikova, 1974; Kulish, Dyakov,
1979). Les soques resistents a dos inhibidors del creixement van sorgir com a resultat de l’heterocariotització del miceli, i en aquest cas es van escindir durant la reproducció per zoospores mononuclears (Judelson, Ge Yang, 1998), o no es van escindir en descendència monozoosporosa, perquè tenien nuclis tetraploides (ja que els aïllats inicials són diploides) (K , 1979). Els diploides heterocigots es van segregar a una freqüència molt baixa a causa de l’haploïdització, la no disjunció del cromosoma i l’encreuament mitòtic (Poedinok et al., 1982). La freqüència d’aquests processos es podria augmentar amb l’ajut de certs efectes sobre els diploides heterozigots (per exemple, la irradiació UV de les espores germinatives).
Tot i que la formació d’híbrids vegetatius amb doble resistència es produeix no només in vitro, sinó també en tubercles de patata infectats amb una barreja de mutants (Kulish et al., 1978), és força difícil avaluar el paper de la recombinació parasexual en la generació de nous genotips en les poblacions. La freqüència de formació de segregants a causa de l’haploïdització, la no disjunció dels cromosomes i el creuament mitòtic sense efectes especials és insignificant (menys de 10-3).
L’aparició de segregants homozigots de soques heterozigotes es pot basar tant en l’encreuament mitòtic com en la conversió de gens mitòtics, que a P. sojae es produeix amb una freqüència de 3 x 10-2 a 5 x 10-5 per locus, depenent de la soca (Chamnanpunt et al. , 2001).
Tot i que la freqüència d’aparició d’heterocarions i diploides heterozigots va resultar ser inesperadament alta (arribant a desenes de per cent), aquest procés només es produeix quan s’acoblen cultius mutants obtinguts de la mateixa soca. Quan s’utilitzen diferents soques aïllades de la natura, no es produeix heterocariotització (o es produeix amb una freqüència molt baixa) a causa de la presència d’incompatibilitat vegetativa (Poedinok i Dyakov, 1981; Anikina et al., 1997b; Cherepennikova-Anikina et al., 2002). En conseqüència, el paper de la recombinació parasexual només es pot reduir a la recombinació intraclonal en nuclis heterozigots i la transició de gens individuals a un estat homozigot sense un procés sexual. Aquest procés pot tenir una importància epidemiològica en soques amb mutacions de resistència fungicida recessives o semi-dominants. La seva transició a un estat homozigòtic a causa del procés parasexual augmentarà la resistència del portador de la mutació (Dolgova, Dyakov, 1986).
Introgressió de gens
Les espècies heterotàl·liques Phytophthora són capaces d’entrecreuar-se amb la formació d’ospores híbrides (vegeu Vorob’eva i Gridnev, 1983; Sansome et al., 1991; Veld et al., 1998). L’híbrid natural de les dues espècies de Phytophthora era tan agressiu que va matar milers de verns al Regne Unit (Brasier et al., 1999). P. infestans es pot presentar amb altres espècies del gènere (P. erythroseptica, P. nicotianae, P. Cactorum, etc.) en plantes hostes comunes i al sòl, però hi ha poca informació a la literatura sobre la possibilitat d’híbrids interespecífics. En condicions de laboratori, es van obtenir híbrids entre P. infestans i P. Mirabilis (Goodwin i Fry, 1994).
Taula 9. La proporció de soques de P. infestans amb tipus d'aparellament A2 en diferents països del món en el període de 1990 a 2000 (segons les dades de fonts de literatura oberta i llocs www.euroblight.net, www.eucablight.org)
País | 1990 | 1991 | 1992 | 1993 | 1994 | 1995 | 1996 | 1997 | 1998 | 1999 | 2000 |
---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|
Bielorússia | 33 (12) | 34 (29) | |||||||||
Bèlgica | 15 (49 *) | 6 (66) | 20 (86) | ||||||||
equador | 0 (13) | 0 (12) | 0 (19) | 0 (21) | 12 (41) | 25 (39) | 15 (75) | 22 (73) | 25 (68) | 0 (35) | |
Estònia | 8 (12) | ||||||||||
Anglaterra | 4 (26) | 3 (630) | 9 (336) | ||||||||
Finlàndia | 0 (15) | 19 (117) | 12 (16) | 21 (447) | 6 (509) | 9 (432) | 43 (550) | ||||
França | 0 (35) | 0 (56) | 0 (83) | 0 (67) | 0 (86) | 2 (135) | 7 (156) | 6 (123) | 0 (73) | 0 (285) | 0 (135) |
Hongria | 72 (32) | ||||||||||
Irlanda | 4 (145) | ||||||||||
Nord. Irlanda | 10 (41) | 9 (58) | 1 (106) | 0 (185) | 0 (18) | 0 (56) | 0 (35) | 0 (26) | |||
Països Baixos | 7 (41) | 5 (276) | 24 (377) | 44 (353) | 23 (185) | ||||||
Норвегия | 25 (446) | 28 (156) | 8 (39) | 18 (257) | 38 (197) | ||||||
Perú | 0 (34, 1984-86) | 0 (287, 1997-98) | 0 (112) | 0 (66) | |||||||
Польша | 19 (180) | 21 (142) | 33 (256) | 26 (149) | 35 (70) | ||||||
Escòcia | 25 (147) | 11 (163) | 22 (189) | 5 (22) | |||||||
Швеция | 25 (263) | 62 (258) | 49 (163) | ||||||||
Gal·les | 0 (16) | 7 (97) | 0 (48) | 0 (25) | |||||||
Corea | 36 (42) | 10 (130) | 15 (98) | ||||||||
Xina | 20 (142, 1995-98) | 0 (6) | 0 (8) | 0 (35) | |||||||
Colòmbia | 0 (40, 1994-2000) | ||||||||||
Uruguai | 100 (25, 1998-99) | ||||||||||
Marroc | 60 (108, 1997-2000) | 52 (25) | 42 (40) | ||||||||
Сербия | 76 (37) | ||||||||||
Mèxic (Toluca) | 28 (292, 1988-89) | 50 (389, 1997-98) |
Taula 10. La proporció de soques de P. infestans amb tipus d'aparellament A2 en diferents països del món entre el 2000 i el 2011
País | 2001 | 2002 | 2003 | 2004 | 2005 | 2006 | 2007 | 2008 | 2009 | 2010 | 2011 |
---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|
Австрия | 65 (83) | ||||||||||
Bielorússia | 42 (78) | ||||||||||
Bèlgica | 20 (102 *) | 4 (32) | 50 (14) | 25 (16) | 62 (13) | 54 (26) | 70 (54) | 30 (23) | 29 (35) | 62 (71) | 45 (49) |
Suïssa | 89 (19) | ||||||||||
Чехия | 35 (31) | 54 (64) | 38 (174) | 12 (80) | |||||||
Alemanya | 95 (53) | ||||||||||
Dinamarca | 48 (52) | ||||||||||
equador | 5 (178) | 6 (108) | 9 (121) | 18 (94) | 2 (44) | 0 (66) | 5 (47) | ||||
Estònia | 54 (25) | 0 (24) | 33 (62) | 45 (140) | 25 (100) | 12 (103) | |||||
Anglaterra | 4 (47) | 10 (96) | 31 (55) | 55 (790) | 68 (862) | 70 (552) | 68 (299) | ||||
Finlàndia | 47 (162) | 12 (218) | 42 | ||||||||
França | 0 (186) | 4 (108) | 8 (61) | 22 (103) | 33 (303) | 65 (378) | 74 (331) | 75 (125) | 75 (12) | ||
Hongria | 48 (27) | 48 (90) | 9 | 7 | |||||||
Nord. Irlanda | 0 (38) | 0 (58) | 0 (40) | 0 (24) | 5 (54) | 0 (18) | 27 (578) | 45 (239) | 36 (213) | 82 (60) | 10 (80) |
Països Baixos | 66 (24) | 93 (15) | 91 (11) | ||||||||
Норвегия | 39 (328) | 3 (115) | 12 (19) | ||||||||
Perú | 0 (36) | ||||||||||
Польша | 25 (46) | 10 (30) | 85 (20) | 38 (44) | 75 (66) | 55 (56) | 65 (35) | 72 (81) | 85 (21) | ||
Escòcia | 3 (213) | 2 (474) | 24 (135) | 86 (337) | 88 (386) | 74 (172) | |||||
Швеция | 60 (277) | 39 (87) | |||||||||
Eslovàquia | 0 (36) | 14 (26) | 62 (26) | 0 (26) | |||||||
Gal·les | 25 (12) | 68 (106) | 80 (88) | 92 (143) | 75 (45) | ||||||
Corea | 46 (26) | ||||||||||
Brasil | 0 (49) | 0 (30) | |||||||||
Xina | 10 (30) | 0 (6) | 0 (6) | ||||||||
Vietnam | 0 (294, 2003-04) | ||||||||||
Uganda | 0 (8) |
Dinàmica de la composició genotípica de les poblacions
Els canvis en la composició genotípica de les poblacions de P. infestans es poden produir sota la influència de la migració de nous clons procedents d'altres regions, de les pràctiques agrícoles (canvi de varietats, aplicació de fungicides) i de les condicions meteorològiques. Les influències externes afecten els clons de manera diferent en diferents etapes del cicle de vida; per tant, les poblacions experimenten anualment canvis cíclics en les freqüències dels gens sotmesos a selecció, a causa d’un canvi en el paper predominant de la deriva i selecció dels gens.
Influència de la varietat
Les noves varietats amb gens efectius de resistència vertical (gens R) són un poderós factor selectiu, que selecciona clons amb gens de virulència complementaris en poblacions de P. infestans. En absència de resistència inespecífica a la varietat de patates, que inhibeix el creixement de la població patògena, el procés de substitució dels clons dominants a la població es produeix molt ràpidament. Així, després de la propagació a la regió de Moscou de la varietat Domodedovsky, que té el gen de resistència R3, la freqüència de clons virulents d’aquesta varietat va augmentar de 0,2 a 0,82 en un any (Dyakov i Derevjagina, 2000).
Tanmateix, el canvi en les freqüències dels gens de virulència (patotips) en les poblacions no només es produeix sota la influència de les varietats de patates cultivades. Per exemple, a Bielorússia fins al 1977, van dominar els clons amb els gens de virulència 1 i 4, cosa que va ser causada pel cultiu de varietats de patates amb gens de resistència R1 i R4 (Dorozhkin, Belskaya, 1979). Tanmateix, a finals dels anys 70 del segle XX, van aparèixer clons amb diferents gens de virulència i les seves combinacions, i els gens de resistència complementaris mai no es van utilitzar en la cria de patates (gens de virulència extra) (Ivanyuk et al., 2002). Aparentment, la raó de l’aparició d’aquests clons es deu a la migració a Europa de material infecciós des de Mèxic amb tubercles de patata. A casa, aquests clons es van desenvolupar no només en patates cultivades, sinó també en espècies silvestres que portaven una gran varietat de gens de resistència; per tant, la combinació de molts gens de virulència en el genoma era necessària per a la supervivència en aquestes condicions.
Pel que fa a les varietats amb resistència inespecífica, en reduir la velocitat de reproducció del patogen, retarden l’evolució de les seves poblacions, que, com ja s’ha dit, és una funció del nombre. Com que l'agressivitat és poligènica, els clons que contenen un major nombre de gens per a "agressivitat" s'acumulen com més aviat més gran és la mida de la població. Per tant, les races altament agressives no són un producte d’adaptació a varietats cultivades amb resistència inespecífica, sinó que, al contrari, és més probable que es detectin a les plantacions de varietats altament susceptibles que són acumuladores de les espores del paràsit.
Així, a Rússia, les poblacions més agressives de P. Infestans es van trobar a zones d’epifitoties anuals (poblacions de les regions de Sakhalin, Leningrad i Bryansk). L’agressivitat d’aquestes poblacions va resultar ser superior a la de les mexicanes (Filippov et al., 2004).
A més, es formen menys oospores a les fulles de varietats resistents que a les susceptibles (Hanson i Shattock, 1998), és a dir, la resistència inespecífica de la varietat també redueix les capacitats de recombinació del paràsit i la possibilitat de mètodes d’hivernada alternatius.
Influència dels fungicides
Els fungicides no només redueixen el nombre de fongs fitopatògens, és a dir, afecten les característiques quantitatives de les seves poblacions, però també poden canviar les freqüències dels genotips individuals, és a dir, influeixen en la composició qualitativa de les poblacions. Entre els indicadors més importants de les poblacions que canvien sota la influència dels fungicides hi ha els següents: canvis en la resistència als fungicides, canvis en l’agressivitat i la virulència i canvis en els sistemes reproductius.
Influència dels fungicides sobre la resistència i l'agressivitat de les poblacions
El grau d’aquest efecte està determinat, en primer lloc, pel tipus de fungicida utilitzat, que es pot dividir condicionalment en polisita, oligosita i monosita.
El primer inclou la majoria dels fungicides de contacte. La resistència a ells (si és possible) està controlada per un gran nombre de gens molt dèbilment expressius. Aquestes propietats determinen l'absència de canvis visibles en la resistència de la població després del tractament amb fungicides (tot i que en alguns experiments es va obtenir un cert augment de la resistència). La població de fongs conservada després de la polvorització amb fungicides de contacte consta de dos grups de soques:
1) Ceps conservats en zones de plantes no tractades amb el medicament. Com que no hi va haver contacte amb el fungicida, l'agressivitat i resistència d'aquestes soques no canvia.
2) Ceps en contacte amb el fungicida, la concentració dels quals en els punts de contacte era inferior a la letal. Com s’ha esmentat anteriorment, la resistència d’aquesta part de la població tampoc no canvia, a causa de l’efecte perjudicial parcial del fungicida, fins i tot en la concentració subletal sobre el metabolisme de la cèl·lula fúngica, la forma física general i el seu component paràsit, l’agressivitat, disminueix (Derevyagina i Dyakov, 1990).
Així, fins i tot una part de la població que no ha mort, exposada al contacte amb el fungicida, presenta una agressivitat feble i no pot ser una font d’epifitòtics. Per tant, un tractament acurat que redueix la freqüència de la proporció de la població que no està en contacte amb el fungicida és una condició per a l’èxit de les mesures de protecció. La resistència als fungicides oligosítics està controlada per diversos gens additius.
La mutació de cada gen condueix a un cert augment de la resistència, i el grau general de resistència es deu a l'addició d'aquestes mutacions. Per tant, l’augment de la resistència es produeix per etapes. Un exemple d'augment gradual de la resistència són les mutacions en la resistència al fungicida dimethomorfo, que s'utilitza àmpliament per protegir les patates de la tos tardana. La resistència al dimetomorf és poligènica i additiva. Una mutació en un pas augmenta lleugerament la resistència.
Cada mutació posterior disminueix la mida objectiu i, en conseqüència, la freqüència de mutacions posteriors (Bagirova et al., 2001). L’increment de la resistència mitjana de la població després de tractaments repetits amb fungicida oligosita es produeix gradualment. La velocitat d’aquest procés està determinada per almenys tres factors: la freqüència de mutació dels gens de resistència, el coeficient de resistència (la proporció de la dosi letal d’una soca resistent en relació amb una de sensible) i l’efecte de les mutacions dels gens de resistència sobre la forma física.
La freqüència d’aparició de cada mutació posterior és inferior a l’anterior; per tant, el procés té un caràcter amortidor (Bagirova et al., 2001). No obstant això, si es produeixen processos de recombinació (sexuals o parasexuals) a la població, és possible combinar diferents mutacions dels pares en una soca híbrida i accelerar el procés. Per tant, les poblacions de panmix adquireixen resistència més ràpidament que les poblacions agàmiques i, en aquesta última, les poblacions que no tenen barreres d’incompatibilitat vegetativa més ràpid que les poblacions separades per aquestes barreres. En aquest sentit, la presència de soques en poblacions que difereixen en els tipus d'aparellament accelera el procés d'adquisició de resistència als fungicides oligosítics.
El segon i el tercer factors no contribueixen a la ràpida acumulació de soques resistents als dimetomorfs en les poblacions. Cada mutació posterior duplica aproximadament la resistència, que és insignificant, i al mateix temps redueix tant la taxa de creixement en un entorn artificial com l’agressivitat (Bagirova et al., 2001; Stem, Kirk, 2004). Potser per això pràcticament no hi ha soques resistents entre les soques de P. infestans naturals, fins i tot aquelles recollides a partir de plantacions de patates tractades amb dimetomorf.
Una població tractada amb un fungicida oligosita també constarà de dos grups de soques: les que no han estat en contacte amb el fungicida i, per tant, no han canviat les característiques inicials (si es troben soques resistents en aquest grup, no s’acumularan a causa de la major agressivitat i competitivitat de les soques sensibles), i soques en contacte amb concentracions subletals del fungicida. És entre aquests darrers que és possible l'acumulació de soques resistents, ja que aquí tenen avantatges respecte a les sensibles.
Per tant, quan s’utilitzen fungicides d’oligosita, no és tan important un tractament exhaustiu com una alta concentració del fàrmac, diverses vegades superior a la dosi letal, ja que amb la mutagènesi per etapes, la resistència inicial de les soques mutades és baixa.
Finalment, les mutacions de la resistència als fungicides monosites són molt expressives, és a dir, una mutació pot reportar un alt nivell de resistència, fins a la pèrdua completa de sensibilitat. Per tant, l’augment de la resistència de les poblacions es produeix molt ràpidament.
Un exemple d’aquests fungicides són les fenilamides, inclòs el fungicida més comú, el metalaxil. Les mutacions de resistència a aquesta sorgeixen amb una freqüència elevada i el grau de resistència dels mutants és molt alt: supera la tensió sensible per un factor de mil o més (Derevyagina et al., 1993). Tot i que la taxa de creixement i l'agressivitat dels mutants resistents disminueix en el context de la mort de soques susceptibles d'un fungicida sistèmic, el nombre de població resistent creix ràpidament i, paral·lelament, la seva agressivitat augmenta. Per tant, després de diversos anys d’utilitzar el fungicida, l’agressivitat de les soques resistents no només pot igualar l’agressivitat de les sensibles, sinó també superar-la (Derevyagina i Dyakov, 1992).
Efecte sobre la recombinació sexual
Atès que l’aparició freqüent del tipus d’aparellament A2 a les poblacions de P. infestans va coincidir amb l’ús intensiu de metalaxil contra el tizó tardà, es va suposar que el metalaxil indueix la conversió del tipus d’aparellament. A P. parasitica, es va demostrar experimentalment aquesta conversió sota l’acció de Chloroneb i metalaxyl (Ko, 1994). Un sol pas en un mitjà amb una concentració baixa de metalaxil va provocar l’aparició d’aïllats homotàl·lics d’una soca de P. infestans sensible al metalaxil amb tipus d’aparellament A1 (Savenkova i Cherepnikova-Anikina, 2002). Durant els passatges posteriors en suports amb una concentració més elevada de metalaxil, no es va detectar ni un sol aïllat del tipus d’aparellament A2, però la majoria d’aïllats, quan es creuaven amb aïllats A2, en lloc d’ospores, formaven acumulacions de miceli lleus i eren estèrils. Els passatges d’una soca resistent amb tipus d’aparellament A2 en suports amb una alta concentració de metalaxil ens van permetre detectar tres formes de canvis de tipus d’aparellament: 1) esterilitat completa quan es creua amb aïllats A1 i A2; 2) homotallisme (formació d’ospores en monocultiu); 3) conversió del tipus d'aparellament A2 a A1. Per tant, el metalaxil pot causar canvis en els tipus d'aparellament en les poblacions de P. infestans i, en conseqüència, recombinació sexual en aquestes.
Efectes sobre la recombinació vegetativa
Alguns gens per a la resistència als antibiòtics van augmentar la freqüència de l'heterocariotització hifal i la diploidització nuclear (Poedinok i Dyakov, 1981). Com es va assenyalar anteriorment, l’heterocariotització de les hifes durant la fusió de diferents soques de P. infestans es produeix molt rarament a causa del fenomen d’incompatibilitat vegetativa d’aquest fong. No obstant això, els gens de resistència a alguns antibiòtics poden tenir efectes secundaris, expressats en superar la incompatibilitat vegetativa. Aquesta propietat la posseïa el gen de resistència a l'estreptomicina mutant 1S-1. La presència d’aquests mutants a les poblacions de fitophthora de camp pot augmentar el flux de gens entre soques i accelerar l’adaptació de tota la població a noves varietats o fungicides.
Alguns fungicides i antibiòtics poden influir en la freqüència de la recombinació mitòtica, que també pot alterar les freqüències del genotip en les poblacions. El fungicida benomil àmpliament utilitzat s’uneix a la beta-tubulina, una proteïna a partir de la qual es construeixen els microtúbuls del citoesquelet i, per tant, altera els processos de separació dels cromosomes a l’anafase de la mitosi, augmentant la freqüència de la recombinació mitòtica (Hastie, 1970).
El fungicida para-fluorofenilalanina, utilitzat per tractar la malaltia holandesa en els oms, té la mateixa propietat. La para-fluorofenilalanina va augmentar la freqüència de recombinació en diploides heterozigots P. infestans (Poedinok et al., 1982).
Canvis cíclics en la composició genotípica de les poblacions en el cicle de vida de P. infestans
El cicle de desenvolupament clàssic de P. infestans a la zona temperada consta de 4 fases.
1) Fase de creixement exponencial de la població (fase policíclica) amb generacions curtes. Aquesta fase normalment comença al juliol i dura 1,5-2 mesos.
2) La fase d’aturar el creixement de la població a causa d’una forta disminució de la proporció de teixit no afectat o l’aparició de condicions meteorològiques desfavorables. Aquesta fase a les granges que realitzen l’eliminació precoç de fulles abans de la collita s’acaba del cicle anual.
3) La fase d’hivernada dels tubercles, acompanyada d’una disminució significativa de la mida de la població a causa de la infecció accidental dels tubercles, el desenvolupament lent de la infecció en ells, l’absència de reinfecció dels tubercles, la podridura i l’abandonament dels tubercles afectats en condicions normals d’emmagatzematge.
4) La fase de desenvolupament lent al sòl i a les plàntules (fase monocíclica), en què la durada de la generació pot arribar a un mes o més (finals de maig - principis de juliol). Normalment, en aquest moment, les fulles malaltes són difícils de detectar fins i tot amb observacions especials.
Fase de creixement exponencial de la població (fase policíclica)
Nombroses observacions (Pshedetskaya, Kozubova, 1969; Borisenok, 1969; Osh, 1969; Dyakov, Suprun, 1984; Rybakova, Dyakov, 1990) van demostrar que al començament de l’epifitotip predominen els clons poc virulents i lleugerament agressius, que posteriorment són substituïts per altres de més virulents i agressius. el ritme de creixement de l'agressivitat de la població és major, menys resistent és la varietat de la planta hoste.
A mesura que la població creix, augmenta la concentració de gens selectivament importants introduïts en varietats comercials (R1-R4) i selectivament neutres (R5-R11). Així doncs, a les poblacions properes a Moscou el 1993, la virulència mitjana des de finals de juliol fins a mitjans d’agost va augmentar de 8,2 a 9,4 i el major augment es va observar per al gen R5 de la virulència selectivament neutra (del 31 al 86% dels clons virulents) (Smirnov, 1996 ).
Una disminució de la taxa de creixement d’una població s’acompanya d’una disminució de l’activitat paràsita de la població. Per tant, en anys depressius, tant el nombre total de races com la proporció de races altament virulentes són inferiors a les epifitòtiques (Borisenok, 1969). Si a l’altura de les condicions meteorològiques epifitòtiques es converteixen en desfavorables per al tizó tardà i la infestació de patates disminueix, també disminueix la concentració de clons altament virulents i agressius (Rybakova et al., 1987).
L’augment de les freqüències de gens que afecten la virulència i l’agressivitat de la població es pot deure a la selecció de clons més virulents i agressius en la població mixta. Per demostrar la selecció, es va desenvolupar un mètode per a l'anàlisi de mutacions neutres, que es va utilitzar amb èxit en poblacions de llevats de quimostats (Adams et al., 1985) i Fusarium graminearum (Wiebe et al., 1995).
La freqüència de mutants resistents a la blasticidina S a la població de camp de P. infestans va disminuir paral·lelament al creixement de l’agressivitat de la població, cosa que indica un canvi en els clons dominants en el procés de creixement de la població (Rybakova et al., 1987).
Fase d'hivernació en tubercles
Durant l’hivernada en tubercles de patata, la virulència i l’agressivitat de les soques de P. infestans disminueixen i la disminució de la virulència es produeix més lentament que l’agressivitat (Rybakova i Dyakov, 1990). Aparentment, en condicions propícies al ràpid creixement de la població (selecció r), els gens de virulència "extra" i l'alta agressivitat són útils, per tant, el desenvolupament d'epifitòtics s'acompanya de la selecció dels clons més virulents i agressius. En condicions de saturació de l’entorn, quan no la taxa de reproducció, sinó la persistència de l’existència en condicions desfavorables (selecció K) juga un paper important, els gens "extra" de virulència i agressivitat redueixen la forma física i els clons amb aquests gens són els primers a extingir-se, de manera que l'agressivitat mitjana i disminueix la virulència de la població.
Fase de vegetació al sòl
Aquesta fase és la més misteriosa del cicle vital (Andrivon, 1995). La seva existència es postula purament especulativament, a causa de la manca d’informació sobre el que li passa al patogen durant un llarg període (de vegades més d’un mes), des de l’aparició de plàntules de patata fins a l’aparició dels primers punts de la malaltia. A partir d’observacions i experiments, es va reconstruir el comportament del fong en aquest període de la vida (Hirst i Stedman, 1960; Boguslavskaya, Filippov, 1976).
Es pot formar esporulació del fong als tubercles infectats del sòl. Les espores resultants germinen amb hifes, que poden vegetar durant molt de temps al sòl. Les espores primàries (formades en tubercles) i secundàries (al miceli del sòl) pugen a la superfície del sòl pels corrents capil·lars, però adquireixen la capacitat d’infectar les patates només després que les seves fulles inferiors baixin i entrin en contacte amb la superfície del sòl. Aquestes fulles (a saber, les primeres taques de la malaltia que es troben sobre elles) no es formen immediatament, sinó després d'un creixement i desenvolupament prolongats de les tapes de patata.
Així, al cicle de vida de P. infestans, també pot existir la fase de vegetació saprotròfica. Si a la fase paràsita del cicle vital l’agressivitat és el component més important de la forma física, aleshores a la fase saprotròfica la selecció té com a objectiu reduir les propietats parasitàries, tal com es demostra experimentalment per a alguns fongs fitopatògens (vegeu Carson, 1993). Per tant, en aquesta fase del cicle, les propietats agressives s’han de perdre de manera més intensa. Però fins ara no s’han dut a terme experiments directes per confirmar els supòsits anteriors.
Els canvis estacionals afecten no només les propietats patògenes de P. infestans, sinó també la resistència als fungicides, que creix en la fase policíclica (durant les epifitoties) i disminueix durant l’emmagatzematge hivernal (Derevyagina et al., 1991; Kadish i Cohen, 1992). Es va observar una caiguda particularment intensa de la resistència al metalaxil en el període comprès entre la plantació dels tubercles afectats i l’aparició de les primeres taques de la malaltia al camp.
Especialització intraespecífica i la seva evolució
P. infestans està causant epidèmies en dos cultius importants comercialment: patates i tomàquet. Les epifitoties de les patates van començar poc després que el fong entrés en noves zones. La derrota del tomàquet també es va notar poc després de l'aparició de la infecció a les patates, però les epifitoties del tomàquet es van observar només cent anys després, a mitjan segle XX. Això és el que escriuen Hallegli i Niederhauser sobre la derrota dels tomàquets als EUA
(1962): “Durant uns 100 anys després del sever epifitotip de 1845, es van fer pocs o gairebé cap intent d’obtenir varietats resistents de tomàquet. Tot i que el tizó tardà es va registrar per primera vegada als tomàquets ja el 1848, no es va convertir en objecte d’una atenció seriosa dels criadors d’aquesta planta fins a un fort brot de la malaltia el 1946. Al territori de Rússia es va registrar la plaga tardana del tomàquet al segle XIX. “Durant molt de temps, els investigadors no van prestar atenció a aquesta malaltia, ja que no va causar danys econòmics significatius. Però als anys 60 i 70. A la Unió Soviètica també s’observen epifitoties del tizó tardà del segle XX, principalment a la regió del Baix Volga, a Ucraïna, al Caucas del Nord, a Moldàvia ... ”(Balashova, 1979).
Des d’aleshores, la tosca del tomàquet s’ha anat estenent anualment, s’estén per tot el territori del cultiu industrial i domèstic i provoca enormes danys econòmics a aquest cultiu. Què va passar? Per què es va produir la primera aparició del paràsit a les patates i la lesió epifitòtica d’aquest cultiu gairebé simultàniament, i per què va passar un segle perquè l’epifitòtic aparegués al tomàquet? Aquestes diferències donen suport a una font d’infecció mexicana en lloc d’una font d’infecció sud-americana. Si l’espècie Phytophthora infestans es va formar com a paràsit de les espècies mexicanes portadores de tubercles del gènere Solanum, és comprensible per què les patates cultivades pertanyents a la mateixa secció del gènere que les espècies mexicanes es van veure tan afectades, però a causa de l’absència de coevolució amb el paràsit, que no va desenvolupar mecanismes de resistència específica i inespecífica.
El tomàquet pertany a una secció diferent del gènere, el tipus d’intercanvi presenta diferències significatives respecte a les espècies tuberoses, per tant, malgrat que el tomàquet no es troba fora de l’especialització alimentària de P. infestans, la intensitat de la seva derrota va ser insuficient per a greus pèrdues econòmiques.
L’aparició d’epifitoties sobre el tomàquet es deu a greus canvis genètics del paràsit, que van augmentar la seva capacitat d’adaptació (patogenicitat) quan es parasitava. Creiem que la nova forma especialitzada per parasitar el tomàquet és la raça T1 descrita per M. Gallegly, que afecta varietats de tomàquet cherry (Red Cherry, Ottawa), resistents a la raça T0 generalitzada a les patates (Gallegly, 1952). Aparentment, una mutació (o una sèrie de mutacions) que va convertir la raça T0 en la raça T1 i va provocar l’aparició de clons molt adaptats a la derrota del tomàquet. Com passa sovint, un augment de la patogenicitat per a un hoste va anar acompanyat del seu descens per un altre, és a dir, va sorgir una especialització intraespecífica inicial, encara no completa, per a les patates (raça T0) i per al tomàquet (raça T1).
Quina és la prova d’aquest supòsit?
- Aparició en patates i tomàquets. A les fulles de tomàquet predomina la cursa T1, mentre que a les fulles de patata és poc freqüent. Segons S.F. Bagirova i T.A. Oreshonkova (inèdit) a la regió de Moscou el 1991-1992, l’aparició de la raça T1 a les plantacions de patates va ser del 0% i a les plantacions de tomàquet: del 100%; el 1993-1995: un 33% i un 90%, respectivament; el 2001: 0% i 67%. Es van obtenir dades similars a Israel (Cohen, 2002). Els experiments amb la infecció de tubercles de patata amb aïllats de la raça T1 i una barreja d’aïllats T0 i T1 van mostrar que els aïllats de la raça T1 es conserven malament als tubercles i que són substituïts per aïllats de la raça T0 (Dyakov et al., 1975; Rybakova, 1988).
2) Dinàmica de la raça T1 en plantacions de tomàquet. La infecció primària de les fulles de tomàquet es duu a terme per aïllats de la raça T0, que dominen en l’anàlisi de la infecció a les primeres taques formades a les fulles. Això confirma l’esquema generalment acceptat de la migració del paràsit: la massa principal d’infecció per patates està formada per la raça T0, però, un petit nombre de clons T1 conservats a les patates, un cop sobre el tomàquet, desplacen la raça T0 i s’acumulen cap al final del període epifitòtic. També és possible que hi hagi una font alternativa d’infecció de fulles de tomàquet amb la raça T1, no tan potent com els tubercles i les fulles de la patata, sinó constant. Per tant, aquesta font té un efecte feble sobre l’estructura genètica de la població que infecta el tomàquet, però posteriorment determina l’acumulació de la raça T1 (Rybakova, 1988; Dyakov et al., 1994).
3) Agressivitat a les patates i els tomàquets. La infecció artificial de tomàquet i fulles de patata amb aïllats de races T0 i T1 va demostrar que els primers són més agressius per a les patates que per al tomàquet i els segons són més agressius per al tomàquet que per a la patata. Aquestes diferències es manifesten en el desplaçament d’aïllats d’una raça no “pròpia” d’una població mixta durant els passatges de fulles en un hivernacle (Dyakov et al., 1975) i en parcel·les de camp (Leberton et al., 1999); diferències en la càrrega infecciosa mínima, el període de latència, la mida de les taques infeccioses i la producció d’espores (Rybakova, 1988; Dyakov et al., 1994; Legard et al., 1995; Forbes et al., 1997; Oyarzun et al., 1998; Leberton et. al., 1999; Vega-Sanchez i altres, 2000; Knapova, Gisi, 2002; Sussuna i altres, 2004).
L’agressivitat dels aïllats de la raça T1 als cultivars de tomàquet que no tenen gens de resistència és tan elevada que aquests aïllats esporen a les fulles com a un mitjà nutritiu sense necrotitzar el teixit infectat (Dyakov et al., 1975; Vega-Sanchez et al., 2000).
4) Virulència per a patates i tomàquets. La raça T1 afecta les varietats de tomàquet cherry amb el gen de resistència Ph1, mentre que la raça T0 no és capaç d’infectar aquestes varietats, és a dir, té una virulència més estreta. En relació als diferenciadors
Els gens R de les patates estan inversament relacionats, és a dir, les soques aïllades de les fulles de tomàquet són menys virulents que les soques de "patata" (taula 11).
5) Marcadors neutres. L'anàlisi de marcadors neutres en les poblacions de P. infestans que parasiten les patates i els tomàquets també testimonia la selecció intraespecífica multidireccional. A les poblacions brasileres de P. infestans, els aïllats de fulles de tomàquet pertanyien a la línia clonal US-1, i els de fulles de patata pertanyien a la línia BR-1 (Suassuna et al., 2004). A Florida (EUA), des del 1994, el clon US-90 va començar a dominar sobre les patates (amb una ocurrència de més del 8%), i els clons US-11 i US-17 sobre el tomàquet, i els aïllats d’aquest últim són més agressius per al tomàquet que per a la patata (Weingartner , Tombolato, 2004). Es van establir diferències significatives en les freqüències del genotip (empremtes digitals d’ADN) en aïllats de patata i tomàquet per a 1200 soques de P. infestans recollides als Estats Units del 1989 al 1995 (Deahl et al., 1995).
El mètode AFLP va permetre separar 74 soques recollides de fulles de patata i tomàquet el 1996-1997. a França i Suïssa, en 7 grups. Les varietats de patata i tomàquet no divergien clarament, però les varietats de "patata" eren genèticament més diverses que les de "tomàquet". Els primers es van trobar als set clústers i els segons només a quatre, cosa que indica un genoma més especialitzat del segon (Knapova i Gisi, 2002).
6) Mecanismes d’aïllament. Si les poblacions del paràsit de dues espècies de plantes hostes evolucionen cap a l’estretament de l’especialització al seu propi hoste, sorgeixen diversos mecanismes pre i postmeiòtics que impedeixen els intercanvis genètics entre la població (Dyakov i Lekomtseva, 1984).
Diversos estudis han investigat l’efecte de la font de soques parentals sobre l’eficiència de la hibridació. Quan es van creuar soques aïllades de diferents espècies del gènere Solanum a l’Equador (Oliva et al., 2002), es va trobar que les soques amb el tipus d’aparellament A2 de solanàcies silvestres (línia clonal EC-2) creuaven el pitjor amb soques de tomàquet (línia EC -3), i es creua de manera més efectiva amb la soca de patata (EC-1).
Es va trobar que tots els híbrids no eren patògens. Els autors creuen que el baix percentatge d’hibridació i la reducció de la patogenicitat en els híbrids es deuen a mecanismes postmeiòtics d’aïllament reproductiu de les poblacions.
En els experiments de Bagirova et al. (1998), es va creuar un gran nombre de soques de patata i tomàquet amb les propietats de les races T0 i T1. Els encreuaments més fèrtils de soques T1xT1 aïllades del tomàquet (36 oospores al camp de visió del microscopi, el 44% de la germinació d’ospores), les menys efectives van ser les creus de races T0xT1 aïllades de diferents hostes (un nombre baix d’ospores en desenvolupament i germinades, una alta proporció d’ospores abortives i subdesenvolupades) ... L'eficiència dels encreuaments entre aïllats de la raça T0 aïllats de patates va ser intermèdia. Atès que el cos principal de soques de la raça T0 afecta les patates, té una font fiable d’hivernada: els tubercles de la patata, com a conseqüència de la qual la importància de les oospores com a unitats infeccioses hivernants per a les poblacions de patates és baixa. La “forma de tomàquet” adaptada és capaç d’hivernar amb el tomàquet en forma d’ospores (vegeu més avall) i, per tant, conserva una productivitat més elevada del procés sexual. A causa de la seva alta fertilitat, T1 adquireix un potencial independent d’infecció primària en tomàquet. Els resultats obtinguts per Knapova et al. (Knapova et al., 2002) es poden interpretar de la mateixa manera. Les creus de soques aïllades de patates amb soques de tomàquet van donar el nombre més alt d’ospores: 13,8 per mm quadrats. mitjà (amb una extensió de 5-19) i un percentatge intermedi de germinació d’ospores (6,3 amb una extensió de 0-24). Els encreuaments de soques aïllades de tomàquet van produir el percentatge més baix d’ospores (7,6 amb una extensió de 4-12) amb el percentatge més alt de germinació (10,8). Els encreuaments entre les soques aïllades de les patates van donar un nombre intermedi d’ospores (8,6 amb una gran dispersió de dades - 0-30) i el percentatge més baix de germinació d’ospores (2,7). Per tant, les soques de patates són menys fèrtils que les de tomàquet, però les creus interpoblacionals no van donar resultats pitjors que les intrapopulacions. És possible que les diferències amb les dades anteriors de Bagirova et al. s’expliquen pel fet que els investigadors russos van treballar amb soques aïllades a principis dels anys 90 del segle XX i els investigadors suïssos, amb soques aïllades a finals dels 90.
La baixa fertilitat es pot deure a heteroploïdies de soques. Si a les poblacions mexicanes, on el procés sexual i la infecció primària amb descendència oosporosa són regulars, la majoria de les soques estudiades de P. Infestans són diploides, en els països del Vell Món s’observa polimorfisme de ploidia intrapopulació (soques di-, tri- i tetraploides, així com soques heterocariotes amb nuclis heteroploides) , i soques que tenen diferents tipus d'aparellament, és a dir, mútuament fèrtils, difereixen en la ploidia nuclear (Therrien et al., 1989, 1990; Whittaker et al., 1992; Ritch, Daggett, 1995). La diversitat de nuclis en antheridia i oogonia pot ser el motiu de la baixa fertilitat.
Pel que fa als intercanvis nuclears entre hifes durant les anastomoses, això s’evita per la incompatibilitat vegetativa, que divideix les poblacions asexuals en molts clons aïllats genèticament (Poedinok i Dyakov, 1987; Gorbunova et al., 1989; Anikina et al., 1997b).
7) Convergència de poblacions. Les dades anteriors indiquen que és possible la hibridació entre les soques de "patata" i "tomàquet" de P. infestans. També és possible la re-infecció recíproca de diferents hostes, tot i que amb una agressivitat reduïda.
Un estudi de marcadors de població en aïllats de camps de patates i tomàquets adjacents el 1993 va mostrar que aproximadament una quarta part dels aïllats aïllats de fulles de tomàquet es van transferir d’un camp de patates veí (Dolgova et al., 1997). Teòricament, es podria suposar que la divergència de poblacions en dos hostes augmentaria i conduiria a l’aparició de formes intraespecífiques especialitzades (f.sp. patata i f.sp. tomàquet), sobretot perquè les oospores poden persistir a les restes vegetals (Drenth et al., 1995 ; Bagirova, Dyakov, 1998) i llavors de tomàquet (Rubin et al., 2001). En conseqüència, els tomàquets tenen actualment una font de regeneració primaveral independent dels tubercles de patata.
Tot i això, tot va passar d’una altra manera. L’hivern amb oospores va permetre al paràsit evitar l’etapa més estreta del seu cicle vital: l’etapa monocíclica de la vegetació al sòl, durant la qual disminueixen les propietats paràsites, que es restauren gradualment a la fase policíclica a l’estiu.
Taula 11. Freqüències de gens de virulència a varietats diferenciadores de patates en soques de P. infestans
País | Any | Nombre mitjà de gens de virulència en soques | Autor | |
de patates | de tomàquet | |||
França | 1995 | 4.4 | 3.3 | Leberton et al., 1999 |
1996 | 4.8 | 3.6 | Leberton, Andrivon, 1998 | |
França, Suïssa | 1996-97 | 6.8 | 2.9 | Knapova, Gisi, 2002 |
EUA | 1989-94 | 5 | 4.8 | Goodwin et al., 1995 |
EUA, Zap. Washington DC | 1996 | 4.6 | 5 | Dorrance et al., 1999 |
1997 | 6.3 | 3.5 | " | |
equador | 1993-95 | 7.1 | 1.3 | Oyarzun et al., 1998 |
Израиль | 1998 | 7 | 4.8 | Cohen, 2002 |
1999 | 6 | 5.7 | " | |
2000 | 6.7 | 6.1 | " | |
Rússia, Mosk. regió | 1993 | 8.9 | 6.7 | Smirnov, 1996 |
Rússia, diferents regions | 1995 | 9.4 | 8 | Kozlovskaya i altres. |
1997 | 9.2 | 9.2 | " | |
2000 | 8.7 | 4.8 | " |
Els zoosporangis primaris i les zoospores, que germinen oospores, tenen un alt grau d’activitat parasitària, especialment si les oospores es van formar partenogenèticament sota la influència de feromones d’una soca amb el tipus d’aparellament oposat. Per tant, el material infecciós de les plàntules de tomàquet cultivades a partir de llavors infectades amb oospores és altament patogen tant per al tomàquet com per a la patata.
Aquests canvis van conduir a una altra reestructuració de la població, expressada en els següents canvis importants des del punt de vista epidemiològic:
- Les plàntules de tomàquet infectades s'han convertit en una font important d'infecció primària de les patates (Filippov, Ivanyuk, missatges personals).
- Les epifitoties de les patates es van començar a observar ja al juny, aproximadament un mes abans de l’habitual.
- A les plantacions de patates, va augmentar el percentatge de raça T1, que anteriorment es trobava allà en una quantitat insignificant (Ulanova et al., 2003).
- Les soques aïllades de fulles de tomàquet van deixar de diferir de les soques de patata en virulència en els diferenciants de gens de virulència i van començar a superar les soques de "patata" en agressivitat no només en el tomàquet, sinó també en les patates (Lavrova et al., 2003; Ulanova et al. , 2003).
Així, en lloc de divergència, hi va haver una convergència de poblacions, l’aparició d’una sola població en dues plantes hostes amb una alta virulència i agressivitat a les dues espècies.
Conclusió
Així, malgrat els més de 150 anys d’estudi intensiu de P. infestans, en biologia, inclosa la biologia de la població d’aquest agent causant de les malalties més importants de les plantes solanàcies cultivades, encara es desconeix molt. No està clar com afecta el pas de les etapes individuals del cicle vital a l’estructura de les poblacions, quins són els mecanismes genètics de la variabilitat canalitzada d’agressivitat i virulència, quina és la relació dels sistemes reproductius i de reproducció clonal en poblacions naturals, com s’hereta la incompatibilitat vegetativa, quin és el paper de les patates i els tomàquets en la infecció primària quin és el seu efecte sobre l’estructura de les poblacions de paràsits. Fins ara no s’han resolt qüestions pràctiques tan importants com els mecanismes genètics per canviar l’agressivitat del paràsit o l’erosió de la resistència inespecífica de la patata. Amb l'aprofundiment i l'expansió de la investigació sobre el tizó tardà de la patata, el paràsit planteja nous reptes per als investigadors. No obstant això, la millora de les capacitats experimentals, l’aparició de nous enfocaments metodològics per a la manipulació amb gens i proteïnes ens permeten esperar una solució exitosa de les preguntes plantejades.
L'article es va publicar a la revista "Potato Protection" (núm. 3, 2017)